استجواب مزدوج خاص بالخلية ل Epigenome المبيض للفأر و Transcriptome
Summary
في هذا البروتوكول ، تم تحسين طريقة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) وعزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT) للاستجواب المزدوج لنسخة المبيض الخاصة بالخلية و epigenome باستخدام نموذج الماوس NuTRAP الذي تم عبوره إلى خط الماوس Cyp17a1-Cre.
Abstract
يعد تقييم التغيرات فوق الجينية والترانسبية الخاصة بنوع الخلية أمرا أساسيا لفهم شيخوخة المبيض. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إجراء تحسين طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) وعزل النوى الموسومة بطريقة أنواع معينة من الخلايا (INTACT) للاستجواب المزدوج اللاحق لنسخة المبيض الخاصة بالخلية و epigenome باستخدام نموذج فأر NuTRAP جديد معدل وراثيا. يخضع تعبير أليل NuTRAP لسيطرة شريط STOP المتخبط ويمكن استهدافه لأنواع معينة من خلايا المبيض باستخدام خطوط Cre الخاصة بالمروج. نظرا لأن الدراسات الحديثة قد ورطت خلايا انسجة المبيض في قيادة الأنماط الظاهرية للشيخوخة المبكرة ، فقد استهدف نظام التعبير NuTRAP الخلايا اللحمية باستخدام برنامج تشغيل Cyp17a1-Cre. كان تحريض بنية NuTRAP خاصا بالخلايا الليفية اللحمية المبيضية ، وتم الحصول على ما يكفي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لدراسات التسلسل من مبيض واحد. يمكن استخدام نموذج NuTRAP والطرق المعروضة هنا لدراسة أي نوع من خلايا المبيض مع خط Cre متاح.
Introduction
المبيضان لاعبان رئيسيان في الشيخوخة الجسدية1 ، مع مساهمات مميزة من مجموعات خلايا معينة. يجعل عدم التجانس الخلوي للمبيض من الصعب تفسير النتائج الجزيئية من فحوصات المبيض الكامل السائبة. يعد فهم دور مجموعات خلايا معينة في شيخوخة المبيض أمرا أساسيا لتحديد الدوافع الجزيئية المسؤولة عن الخصوبة والتدهور الصحي لدى النساء المسنات. تقليديا ، تم تحقيق التقييم متعدد الأوميكس لأنواع معينة من خلايا المبيض من خلال تقنيات مثل التشريح المجهريبالليزر 2 ، أو نهج الخليةالمفردة 3 ، أو فرز الخلايا4. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التشريح المجهري مكلفا ويصعب تنفيذه ، ويمكن أن يغير فرز الخلايا ملامح النمط الظاهري الخلوي5.
يستخدم نهج جديد لتقييم الملامح اللاجينومية والنسخ الخاصة بنوع خلايا المبيض نموذج الماوس النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP). يسمح نموذج NuTRAP بعزل الأحماض النووية الخاصة بنوع الخلية دون الحاجة إلى فرز الخلايا باستخدام طرق تنقية التقارب: ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) وعزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT)6. يخضع تعبير أليل NuTRAP لسيطرة شريط STOP المتخبط ويمكن استهدافه لأنواع معينة من خلايا المبيض باستخدام خطوط Cre الخاصة بالمروج. من خلال عبور ماوس NuTRAP بخط Cre خاص بنوع الخلية ، تؤدي إزالة شريط STOP إلى وضع علامات eGFP على مركب الريبوسوم ووضع علامات على البيوتين / mCherry للنواة بطريقة تعتمد على Cre6. يمكن بعد ذلك استخدام تقنيات TRAP و INTACT لعزل mRNA والحمض النووي النووي من نوع الخلية محل الاهتمام والمضي قدما في التحليلات النسخية وفوق الجينومية.
تم استخدام نموذج NuTRAP في أنسجة مختلفة ، مثل الأنسجة الدهنية6 ، وأنسجة المخ7،8،9 ، وشبكية العين10 ، للكشف عن التغيرات فوق الجينية والنسخ الخاصة بنوع الخلية والتي قد لا يتم اكتشافها في تجانس الأنسجة الكاملة. تشمل فوائد نهج NuTRAP على تقنيات فرز الخلايا التقليدية ما يلي: 1) منع القطع الأثرية التنشيطية خارج الجسم الحي 8 ، 2) تقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة (أي فارزات الخلايا) ، و 3) زيادة الإنتاجية وانخفاض تكلفة التحليلات الخاصة بنوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القدرة على عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من فأر واحد تسمح بإجراء تحليلات مزدوجة تزيد من القوة الإحصائية. نظرا لأن الدراسات الحديثة قد ورطت خلايا انسجة المبيض في قيادة الأنماط الظاهرية للشيخوخة المبكرة 11،12،13 ، فقد استهدفنا نظام تعبير NuTRAP للخلايا اللحمية والخلايا الثيكا باستخدام برنامج تشغيل Cyp17a1-Cre. هنا ، نوضح أن تحريض بنية NuTRAP خاص بخلايا انسجة المبيض وخلايا الثيكا ، ويتم الحصول على ما يكفي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لدراسات التسلسل من مبيض واحد. يمكن استخدام نموذج NuTRAP والطرق المعروضة هنا لدراسة أي نوع من خلايا المبيض مع أي خط Cre متاح.
لتوليد خط فأر NuTRAP المبيض الخاص بنوع الخلية ، يحتوي أليل الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) على كودون STOP متخبط يتحكم في التعبير عن BirA ، وببتيد التعرف على البيوتين ليجاز (BLRP) الموسوم mCherry / mRANGAP1 ، و eGFP / L10a. عند عبوره بخط Cre خاص بنوع الخلية ، فإن تعبير كاسيت NuTRAP يسمي البروتين النووي mRANGAP1 مع البيوتين / mCherry والبروتين الريبوسومي L10a مع eGFP بطريقة تعتمد على Cre. هذا يسمح بعزل النوى و mRNA من أنواع معينة من الخلايا دون الحاجة إلى فرز الخلايا. يمكن إقران NuTRAP flox/ flox مع Cre خاص بنوع الخلية ذي الصلة بأنواع خلايا المبيض لتقييم ذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الماوس NuTRAP6 هو نهج قوي لوضع العلامات المعدلة وراثيا للاستجواب المزدوج للنسخ و epigenome من أنواع معينة من الخلايا التي يمكن تكييفها مع أي نوع من الخلايا مع برنامج تشغيل Cre متاح. هنا ، نوضح خصوصية نموذج الماوس Cyp17-NuTRAP في استهداف خلايا المبيض والخلايا اللحمية. يمكن استخدام نموذ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01AG070035 ، R01AG069742 ، T32AG052363) ، مؤسسة BrightFocus (M2020207) ، ومؤسسة الصحة المشيخية. تم دعم هذا العمل جزئيا أيضا من خلال جائزة MERIT I01BX003906 وجائزة برنامج تقييم المعدات المشتركة (ShEEP) ISIBX004797 من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وزارة شؤون المحاربين القدامى ، خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مركز الجينوم السريري (OMRF) ومرفق التصوير الأساسي (OMRF) على المساعدة واستخدام الأدوات.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
Referencias
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
