חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק
Summary
בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.
Abstract
הערכת שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא הם המפתח להבנת הזדקנות השחלות. לשם כך, האופטימיזציה של שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) בוצעה לצורך חקירה זוגית עוקבת של תעתיק השחלות והאפיגנום הספציפיים לתא באמצעות מודל עכבר NuTRAP מהונדס חדשני. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת, מערכת הביטוי NuTRAP התמקדה בתאי סטרומה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. השראת מבנה NuTRAP הייתה ספציפית לפיברובלסטים סטרומה בשחלות, והתקבלו מספיק DNA ו-RNA למחקרי ריצוף משחלה יחידה. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם קו Cre זמין.
Introduction
השחלות הן שחקניות מרכזיות בהזדקנות סומטית1, עם תרומות שונות מאוכלוסיות תאים ספציפיות. ההטרוגניות התאית של השחלה מקשה על פירוש התוצאות המולקולריות מבדיקות שחלה שלמות בתפזורת. הבנת התפקיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות בהזדקנות השחלות היא המפתח לזיהוי הגורמים המולקולריים האחראים לפוריות ולירידה בבריאות אצל נשים מזדקנות. באופן מסורתי, ההערכה הרב-אומית של סוגי תאי שחלה ספציפיים הושגה על ידי טכניקות כגון מיקרודיסקציה לייזר2, גישות חד-תאיות3 או מיון תאים4. עם זאת, מיקרודיסקציה יכולה להיות יקרה וקשה לביצוע, ומיון תאים יכול לשנות פרופילים פנוטיפיים תאיים5.
גישה חדשנית להערכת פרופילים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג תאי השחלות משתמשת במודל העכבר NuTRAP (ראשי תיבות של Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification). מודל NuTRAP מאפשר בידוד של חומצות גרעין ספציפיות לסוג התא ללא צורך במיון תאים באמצעות שיטות טיהור הזיקה: תרגום טיהור זיקה ריבוזומים (TRAP) ובידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT)6. הביטוי של אלל NuTRAP נמצא תחת שליטה של קלטת STOP floxed וניתן לכוון אותו לסוגי תאי שחלה ספציפיים באמצעות קווי Cre ספציפיים למקדם. על ידי חציית עכבר NuTRAP עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הסרת קלטת STOP גורמת לתיוג eGFP של הקומפלקס הריבוזומלי ותיוג ביוטין/mCherry של הגרעין באופן תלוי Cre6. לאחר מכן ניתן להשתמש בטכניקות TRAP ו- INTACT כדי לבודד mRNA ו- DNA גרעיני מסוג התא המעניין ולהמשיך לניתוחים שעתוק ואפיגנומיים.
מודל NuTRAP שימש ברקמות שונות, כגון רקמת שומן6, רקמת מוח 7,8,9 ורשתית10, כדי לחשוף שינויים אפיגנומיים ושעתוק ספציפיים לסוג התא שעשויים שלא להיות מזוהים בהומוגנט של רקמה שלמה. היתרונות של גישת NuTRAP על פני טכניקות מסורתיות של מיון תאים כוללים: 1) מניעת ממצאים אקטיבציוניים של ex vivo 8, 2) הצורך הממוזער בציוד מיוחד (כלומר, ממייני תאים), ו -3) התפוקה המוגברת והעלות המופחתת של ניתוחים ספציפיים לסוג התא. בנוסף, היכולת לבודד דנ”א ורנ”א ספציפיים לסוג התא מעכבר בודד מאפשרת ניתוחים זוגיים המגבירים את הכוח הסטטיסטי. מכיוון שמחקרים אחרונים קשרו תאי סטרומה בשחלות בהנעת פנוטיפים של הזדקנות מוקדמת 11,12,13, כיוונו את מערכת הביטוי NuTRAP לתאי סטרומה ותקה באמצעות דרייבר Cyp17a1-Cre. כאן, אנו מראים כי השראת מבנה NuTRAP היא ספציפית לתאי סטרומה ותקה בשחלות, ומספיק DNA ו- RNA למחקרי ריצוף מתקבלים משחלה אחת. ניתן להשתמש במודל NuTRAP ובשיטות המוצגות כאן כדי לחקור כל סוג תא שחלה עם כל קו Cre זמין.
ליצירת קו עכברי NuTRAP ספציפי לסוג התא, אלל התיוג והתרגום הגרעיני של טיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) כולל קודון STOP floxed השולט בביטוי של BirA, פפטיד זיהוי ליגאז ביוטין (BLRP) המתויג mCherry/mRANGAP1 ו-eGFP/L10a. כאשר חוצים אותו עם קו Cre ספציפי לסוג התא, הביטוי של קלטת NuTRAP מתייג את החלבון הגרעיני mRANGAP1 עם ביוטין/mCherry ואת החלבון הריבוזומלי L10a עם eGFP באופן תלוי Cre. זה מאפשר בידוד של גרעינים ו-mRNA מסוגי תאים ספציפיים ללא צורך במיון תאים. ניתן להתאים אתNuTRAP flox/flox עם Cre ספציפי לסוג התא הרלוונטי לסוגי תאי השחלות כדי להעריך זאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
עכבר NuTRAP מודל6 הוא גישת תיוג מהונדס רבת עוצמה לחקירה זוגית של התמליל והאפיגנום מסוגי תאים ספציפיים שניתן להתאים לכל סוג תא עם מנהל התקן Cre זמין. כאן, אנו מדגימים את הספציפיות של מודל העכבר Cyp17-NuTRAP בהתמקדות בתאי תקה וסטרומה בשחלות. ניתן להשתמש במודל Cyp17-NuTRAP כדי להבהיר עוד יותר את ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), קרן BrightFocus (M2020207) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי פרס MERIT I01BX003906 ופרס תוכנית הערכת ציוד משותף (ShEEP) ISIBX004797 מארה”ב (ארה”ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית. המחברים רוצים גם להודות למרכז הגנומיקה הקלינית (OMRF) ולמתקן הליבה של הדימות (OMRF) על הסיוע והשימוש במכשירים.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
Referencias
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
