عزل الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية والتعرض لمستويات مضبوطة من إجهاد القص والتمدد
Summary
وصفنا بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). كما نقدم طرقا مفصلة لإنتاج إجهاد القص والتمدد لدراسة الإجهاد الميكانيكي في hSVECs.
Abstract
جراحة مجازة الشريان التاجي (CABG) هي إجراء لإعادة توعية عضلة القلب الإقفارية. لا يزال الوريد الصافن يستخدم كقناة تحويل مسار الشريان التاجي على الرغم من انخفاض المباح على المدى الطويل مقارنة بالقنوات الشريانية. تؤدي الزيادة المفاجئة في إجهاد الدورة الدموية المرتبط بالشريان الطعم إلى تلف الأوعية الدموية ، وخاصة البطانة ، التي قد تؤثر على انخفاض سالكية طعم الوريد الصافن (SVG). هنا ، نصف عزل وتوصيف وتوسع الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). تعرض الخلايا المعزولة عن طريق هضم الكولاجين مورفولوجيا الحصاة النموذجية وتعبر عن علامات الخلايا البطانية CD31 و VE-cadherin. لتقييم تأثير الإجهاد الميكانيكي ، تم استخدام البروتوكولات في هذه الدراسة للتحقيق في المحفزين الفيزيائيين الرئيسيين ، إجهاد القص والتمدد ، على SVGs الشريانية. يتم استزراع hSVECs في غرفة تدفق لوحة متوازية لإنتاج إجهاد القص ، مما يدل على المحاذاة في اتجاه التدفق وزيادة التعبير عن KLF2 و KLF4 و NOS3. يمكن أيضا استزراع hSVECs في غشاء سيليكون يسمح بالتمدد الخلوي المتحكم فيه الذي يحاكي التمدد الوريدي (المنخفض) والشرياني (العالي). يتم تعديل نمط F-actin للخلايا البطانية وإفراز أكسيد النيتريك (NO) وفقا لذلك من خلال الامتداد الشرياني. باختصار ، نقدم طريقة مفصلة لعزل hSVECs لدراسة تأثير الإجهاد الميكانيكي الديناميكي للدورة على النمط الظاهري البطاني.
Introduction
يعد خلل الخلايا البطانية (EC) لاعبا رئيسيا في فشل ترقيع الوريد الصافن1،2،3،4. تؤدي الزيادة المستمرة في إجهاد القص والتمدد الدوري إلى تحفيز النمط الظاهري الالتهابي للخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs) 3،4،5،6. لا تزال المسارات الجزيئية الأساسية غير مفهومة تماما ، وقد تستفيد البروتوكولات الموحدة للدراسات في المختبر من الجهود المبذولة للحصول على رؤى جديدة في المنطقة. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا لعزل وتوصيف وتوسيع hSVECs وكيفية تعريضها لمستويات متغيرة من إجهاد القص والتمدد الدوري ، ومحاكاة ظروف الدورة الدموية الوريدية والشريانية.
يتم عزل hSVECs عن طريق حضانة كولاجيناز ويمكن استخدامها حتى المقطع 8. يتطلب هذا البروتوكول معالجة أقل للسفينة مقارنة بالبروتوكولات الأخرىالمتاحة 7 ، مما يقلل من التلوث بخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. من ناحية أخرى ، فإنه يتطلب جزءا أكبر من الوعاء لا يقل عن 2 سم للحصول على استخراج EC بكفاءة. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن أنه يمكن أيضا الحصول على ECs من السفن الكبيرة عن طريق الإزالة الميكانيكية 7,8. على الرغم من فعاليته ، إلا أن النهج المادي له عيوب انخفاض إنتاجية EC وتلوث الخلايا الليفية العالي. لزيادة النقاء ، هناك حاجة إلى خطوات إضافية باستخدام الخرز المغناطيسي أو فرز الخلايا ، مما يزيد من تكلفة البروتوكول بسبب الحصول على الخرز والأجسام المضادة 7,8. الطريقة الأنزيمية لها نتائج أسرع وأفضل فيما يتعلق بنقاوة EC وصلاحيتها 7,8.
أكثر الخلايا البطانية استخداما لدراسة الخلل البطاني هي الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). من المعروف أن النمط الظاهري EC يتغير في أسرة الأوعية الدموية المختلفة ، ومن الضروري تطوير طرق تمثل الوعاء قيد التحقيق 9,10. في هذا الصدد ، يعد إنشاء بروتوكول لعزل hSVEC واستزراعه تحت الضغط الميكانيكي أداة قيمة لفهم مساهمة خلل hSVEC في مرض الكسب غير المشروع في الوريد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب أن يكون جزء الوريد الصافن 2 سم على الأقل لعزل hSVECs بنجاح. يصعب التعامل مع الأجزاء الصغيرة وربط نهايات الوعاء للحفاظ على محلول كولاجيناز لعزل الخلايا. لا تنتج مساحة سطح اللمعية المخفضة خلايا كافية لتوسيع الثقافة. لتقليل مخاطر التلوث بغير ECs ، يجب أن يكون التلاعب بجزء الوريد الصافن لطيفا ج…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم JEK بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 and 2013/17368-0] و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 و 309179/2013-0). يتم دعم AAM بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911 / 2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Referencias
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
