ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露
Summary
ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)を単離および培養するためのプロトコルについて述べる。また、hSVECの機械的応力を研究するために、せん断応力と伸張を生成するための詳細な方法も提供しています。
Abstract
冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術は、虚血性心筋を血行再建する手順です。伏在静脈は、動脈導管と比較して長期的な開存性が低下しているにもかかわらず、CABG導管として使用され続けています。移植片動脈化に関連する血行動態ストレスの急激な増加は、伏在静脈移植片(SVG)の低い開存性に影響を与える可能性のある血管損傷、特に内皮をもたらします。ここでは、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、特性評価、および増殖について説明します。コラゲナーゼ消化によって単離された細胞は、典型的な石畳の形態を示し、内皮細胞マーカーCD31およびVE-cadherinを発現します。機械的ストレスの影響を評価するために、この研究ではプロトコルを使用して、動脈化されたSVGに対する2つの主要な物理的刺激であるせん断応力と伸張を調査しました。 hSVECは、平行プレートフローチャンバーで培養されてせん断応力を生成し、流れの方向に整列し、KLF2、KLF4、およびNOS3の発現が増加しました。hSVECは、静脈(低)および動脈(高)の伸展を模倣した細胞伸長を制御できるシリコン膜で培養することもできます。内皮細胞のF-アクチンパターンと一酸化窒素(NO)分泌は、動脈の伸展によってそれに応じて調節されます。要約すると、内皮表現型に対する血行力学的機械的ストレスの影響を研究するために、hSVECを単離するための詳細な方法を提示します。
Introduction
内皮細胞(EC)機能不全は、伏在静脈グラフト不全の重要なプレーヤーです1,2,3,4。せん断応力と周期的伸展の持続的な増加は、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の炎症誘発性表現型を誘導します3,4,5,6。基礎となる分子経路はまだ完全には理解されておらず、in vitro研究のための標準化されたプロトコルは、この分野における新しい洞察のための努力を活用する可能性があります。ここでは、hSVECを単離、特性評価、拡張するための簡単なプロトコルと、静脈および動脈の血行動態状態を模倣して、hSVECをさまざまなレベルのせん断応力と周期的伸展にさらす方法について説明します。
hSVECはコラゲナーゼインキュベーションによって単離され、継代8まで使用することができます。このプロトコルは、平滑筋細胞および線維芽細胞による汚染を減少させる他の利用可能なプロトコル7と比較して、血管の操作が少なくて済む。一方、効率的なEC抽出を行うには、少なくとも2cmのより大きな血管セグメントが必要です。文献では、大型容器からのECは機械的除去によっても得られることが報告されています7,8。物理的アプローチは効果的であるが、EC収率が低く、線維芽細胞汚染が高いという欠点がある。純度を上げるには、磁気ビーズまたは細胞ソーティングを使用した追加のステップが必要であり、ビーズと抗体の取得によりプロトコルのコストが増加します7,8。酵素法は、ECの純度と生存率に関してより速く、より良い結果をもたらします7,8。
内皮機能障害の研究に最も頻繁に使用されるECは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)です。EC表現型は血管床によって変化することが知られており、調査中の血管を表す方法を開発することが不可欠である9,10。この点で、hSVECを単離し、機械的ストレス下で培養するためのプロトコルの確立は、静脈移植疾患におけるhSVEC機能障害の寄与を理解するための貴重なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
伏在静脈セグメントは、hSVECを正常に分離するために少なくとも2 cmである必要があります。小さなセグメントは、細胞を単離するためのコラゲナーゼ溶液を維持するために、取り扱いや血管の端を結ぶのが困難です。管腔表面積の減少は、培養を拡大するのに十分な細胞を生じさせない。非ECによる汚染のリスクを最小限に抑えるために、伏在静脈セグメントの操作は、手順全体を通して非?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEKは、サンパウロ国立科学財団(FAPESP-INCT-20214/50889-7および2013/17368-0)および国立科学芸術財団CNPq(INCT-465586/2014-7および309179/2013-0)からの助成金によって支援されています。AAMは、サンパウロ国立財団(FAPESP 2015/11139-5)およびコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ-CNPq(ユニバーサル-407911/2021-9)からの助成金によって支援されています。
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Referencias
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
