Impianto di minipompa osmotica per aumentare la concentrazione di glucosio nel liquido cerebrospinale di topo
Summary
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per aumentare la concentrazione di glucosio nel liquido cerebrospinale (CSF) dei topi. Questo approccio può essere utile per studiare gli effetti del glucosio CSF alto sulla neurodegenerazione, sulla cognizione e sul metabolismo periferico del glucosio nei topi.
Abstract
Il diabete aumenta il rischio di declino cognitivo e compromette la funzione cerebrale. Se questa relazione tra glucosio alto e deficit cognitivi sia causale rimane elusiva. Inoltre, non è chiaro se questi deficit siano mediati da un aumento dei livelli di glucosio nel liquido cerebrospinale (CSF) e / o nel sangue. Ci sono pochissimi studi che studiano gli effetti diretti di alti livelli di glucosio nel liquido cerebrospinale sulla funzione del sistema nervoso centrale (SNC), in particolare sull’apprendimento e sulla memoria, poiché gli attuali modelli di diabete non sono sufficientemente sviluppati per affrontare tali domande di ricerca. Questo articolo descrive un metodo per aumentare cronicamente i livelli di glucosio nel CSF per 4 settimane infondendo continuamente glucosio nel ventricolo laterale utilizzando minipompe osmotiche nei topi. Il protocollo è stato convalidato misurando i livelli di glucosio nel liquido cerebrospinale. Questo protocollo ha aumentato i livelli di glucosio nel CSF a ~ 328 mg / dL dopo l’infusione di una soluzione di glucosio al 50% a una velocità di flusso di 0,25 μL / h, rispetto a una concentrazione di glucosio nel CSF di ~ 56 mg / dL nei topi che hanno ricevuto liquido cerebrospinale artificiale (aCSF). Inoltre, questo protocollo non ha influenzato i livelli di glucosio nel sangue. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per determinare gli effetti diretti di glucosio CSF alto sulla funzione cerebrale o su uno specifico percorso neurale indipendentemente dai cambiamenti nei livelli di glucosio nel sangue. Nel complesso, l’approccio qui descritto faciliterà lo sviluppo di modelli animali per testare il ruolo dell’alto livello di glucosio nel liquido cerebrospinale nelle caratteristiche di mediazione della malattia di Alzheimer e / o di altri disturbi neurodegenerativi associati al diabete.
Introduction
Sia il diabete di tipo 1 che quello di tipo 2 compromettono la funzione cerebrale 1,2,3. Ad esempio, il diabete aumenta il rischio di declino cognitivo e disturbi neurodegenerativi, tra cui il morbo di Alzheimer 3,4. Inoltre, le persone con diabete hanno un rilevamento del glucosio difettoso nel cervello 5,6. Questo difetto contribuisce alla patogenesi dell’inconsapevolezza associata all’ipoglicemia e ad una risposta controregolatoria insufficiente all’ipoglicemia7,8, che può essere fatale se non trattata immediatamente.
Considerando che il diabete aumenta i livelli di glucosio nel sangue e nel liquido cerebrospinale (CSF)9, è importante determinare se uno o entrambi questi fattori contribuiscono alla compromissione della funzione cerebrale. Se il diabete provoca danni cerebrali da alto glucosio CSF da solo o in combinazione con altri fattori come la carenza di insulina o insulino-resistenza è anche una questione aperta. I modelli animali di diabete di tipo 1 e di tipo 2 mostrano declino cognitivo e neurodegenerazione oltre a un bilancio energetico influenzato e al metabolismo periferico del glucosio10,11,12,13. Tuttavia, da questi modelli, non è possibile disaccoppiare gli effetti selettivi di alti livelli di glucosio nel CSF rispetto ai livelli di glucosio nel sangue nel mediare le complicanze del diabete sulla funzione cerebrale.
Questo protocollo descrive i metodi per sviluppare un modello murino di iperglicorrichia per testare gli effetti di livelli di glucosio cronicamente elevati nel CSF sulla funzione cerebrale, sul bilancio energetico e sull’omeostasi del glucosio. Il modello murino sviluppato attraverso questa tecnica presenta uno strumento per studi che indagano il ruolo eziologico dell’omeostasi del glucosio disregolata sulla funzione neurale e comportamentale.
Pertanto, l’approccio proposto sarà utile per comprendere gli effetti diretti di elevati livelli di glucosio nel liquido cerebrospinale in varie condizioni fisiopatologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo riporta un protocollo dettagliato per aumentare il glucosio nel liquido cerebrospinale nei topi utilizzando minipompe osmotiche collegate a una cannula impiantata nel ventricolo laterale. L’infusione cronica di glucosio nel cervello del topo attraverso questa procedura sarà utile per delineare gli effetti dell’iperglicorrichia a lungo termine sulla cognizione, sul metabolismo sistemico del glucosio e sul bilancio energetico e per una migliore comprensione della patogenesi delle complicanze del diabete.</…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il National Institutes of Health concede DK124619 a KHC.
Premio per i fondi di avviamento e la ricerca pilota, Dipartimento di Medicina, Università di Rochester, NY, a KHC.
Il Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, Università di Rochester, a KHC.
Premio per la ricerca universitaria, Ufficio del vicepresidente per la ricerca, Università di Rochester, NY, a KHC.
MUR ha progettato ed eseguito il metodo, analizzato i risultati, preparato grafici e figure e scritto e modificato il manoscritto. KHC ha concepito e supervisionato lo studio, analizzato i risultati e scritto e modificato il manoscritto. KHC è il garante di questo lavoro. Tutti gli autori hanno approvato la versione finale del manoscritto.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
Referencias
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