De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten
Summary
Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.
Abstract
Weefselspecifieke neurale stamcellen (NSC’s) blijven actief in de postnatale hersenen van zoogdieren. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches, waar ze nieuwe neuronen en glia genereren. Een van die niches is de subependymale zone (SEZ; ook wel de ventriculair-subventriculaire zone genoemd), die zich over de laterale wanden van de laterale ventrikels bevindt, grenzend aan de ependymale cellaag. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC’s) zijn overvloedig verspreid over het centrale zenuwstelsel en vormen een pool van proliferatieve voorlopercellen die oligodendrocyten kunnen genereren.
Zowel NSC’s als OPC’s vertonen zelfvernieuwingspotentieel en rust-/activeringscycli. Vanwege hun locatie wordt het isolement en experimenteel onderzoek van deze cellen postmortaal uitgevoerd. Hier beschrijven we in detail “hersenmelken”, een methode voor het isoleren van NSC’s en OPC’s, naast andere cellen, uit levende dieren. Dit is een protocol in twee stappen dat is ontworpen voor gebruik bij knaagdieren en is getest bij ratten. Eerst worden cellen “vrijgemaakt” uit het weefsel via stereotactische intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie van een “release cocktail”. De belangrijkste componenten zijn neuraminidase, dat zich richt op ependymale cellen en ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor-2. Bij een tweede “verzamelingsstap” worden vloeibare biopsieën van hersenvocht uitgevoerd vanuit de cisterna magna, bij verdoofde ratten zonder dat een incisie nodig is.
De hier gepresenteerde resultaten laten zien dat geïsoleerde cellen hun endogene profiel behouden en dat NSC’s van de SEZ hun rust behouden. De denudatie van de ependymale laag is beperkt tot het anatomische niveau van injectie en het protocol (vrijgave en verzameling) wordt goed verdragen door de dieren. Deze nieuwe benadering maakt de weg vrij voor het uitvoeren van longitudinale studies van endogene neurogenese en gliogenese bij proefdieren.
Introduction
Weefselspecifieke stamcellen zijn gedeeltelijk geëngageerde cellen die aanleiding kunnen geven tot alle celpopulaties waaruit de respectieve weefsels bestaan. Behalve dat ze multipotent zijn, zijn het zelfvernieuwende cellen en cruciaal voor het behoud van de homeostase en het regeneratieve vermogen vanweefsels1. Sommige weefselspecifieke stamcellen blijven in een actieve, sterk proliferatieve toestand, zoals intestinale of hematopoëtische stamcellen. Andere, zoals hersenstamcellen, blijven grotendeels rustig of slapend2. In het volwassen brein zijn neurale stamcellen (NSC’s) te vinden in gespecialiseerde gebieden, vaak niches genoemd. Twee van dergelijke goed beschreven gebieden bestaan in de subependymale zone (SEZ) van de laterale ventrikels en in de gyrus dentatus van de hippocampus. De SEZ-niche genereert het hoogste aantal cellen, voornamelijk neuroblasten die naar de bulbus olfactorius migreren en bijdragen aan de lokale interneuronpopulatie; daarentegen migreren gegenereerde oligodendroblasten naar het aangrenzende corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC’s) zijn mitotisch actieve cellen, wijd verspreid over het centrale zenuwstelsel, die: i) toegewijd zijn aan de oligodendrogliale afstamming, ii) kunnen migreren naar plaatsen van demyelinisatie en iii) kunnen differentiëren tot myeliniserende oligodendrocyten. OPC’s vertonen ook zelfvernieuwingspotentieel en rust4.
Tot nu toe vereiste de isolatie en studie van NSC’s en OPC’s postmortale dissociatie van het ontlede hersen- en ruggenmergweefsel. Om deze experimentele beperking te omzeilen, hebben we een methode ontwikkeld die voor het eerst de isolatie van hersen-NSC’s en OPC’s van levende dieren mogelijk maakt. We noemen deze methode “melken”, omdat het meerdere verzamelingen van cellen mogelijk maakt omdat hun poelen niet uitgeput raken. Het protocol is ontwikkeld bij ratten, vanwege hun grote hersenomvang, voornamelijk gericht op de SEZ, of de CC, en omvat twee belangrijke stappen. Eerst worden NSC’s of OPC’s uit het weefsel “verwijderd” via i.c.v. injectie van een “release cocktail” die neuraminidase bevat, een toxine dat ventriculaire wanddenudatie induceert, een integrine-β1-blokkerend antilichaam en fibroblastgroeifactor 2 (FGF2). De cocktail wordt stereotaxisch bilateraal geïnjecteerd in de laterale ventrikels. Als het beoogde gebruik de isolatie van NSC’s is, zijn rostrale gebieden van de laterale ventrikels het doelwit. Als het doel is om OPC’s zuiverder te isoleren, wordt de cocktail caudaal geïnjecteerd in het gebied van de hippocampusfimbrie. Bij een tweede “verzamelingsstap” worden vloeibare biopsieën van cerebrospinale vloeistof (CSF) uitgevoerd vanuit de cisterna magna van verdoofde ratten, zonder dat een incisie nodig is. De vloeibare biopsie wordt gemengd met NSC-kweekmedium en kan tot het uitplateren bij 4 °C worden bewaard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stam- en voorlopercellen zijn relatief schaars in hersenweefsel van zoogdieren. Bovendien bevinden NSC’s zich in gebieden die niet toegankelijk zijn voor gemakkelijke en veilige biopsieën (ventriculaire wanden, hippocampus). Daarom is de enige manier om experimenteel met dergelijke cellen te werken, tot nu toe, hun postmortale isolatie geweest. Een methode die het mogelijk maakt om NSC’s en OPC’s van levende ratten enkelvoudig of herhaaldelijk te verzamelen, genaamd melken, wordt hier stap voor stap beschreven. De metho…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van Action Medical Research (UK) (GN2291) aan R.J.M.F. en I.K. Het onderzoekswerk werd ook gedeeltelijk ondersteund (dierlijke kosten en steun aan D.D.) door de Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) in het kader van de “Eerste oproep voor H.F.R.I.-onderzoeksprojecten ter ondersteuning van faculteitsleden en onderzoekers en de aanschaf van dure onderzoeksapparatuur” (projectnummer: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Referencias
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
