Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Summary

Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

La unidad organizativa básica de la cromatina eucariota es la partícula del núcleo del nucleosoma (NCP), que comprende el ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor de un octámero de histonas. La cromatina se define como la entidad de los NCP y muchos otros complejos proteicos, incluidos los factores de transcripción, la remodelación de la cromatina y las enzimas modificadoras. Todavía no está claro cómo se orquestan estas interacciones proteína-ADN a nivel de loci genómicos específicos durante las diferentes etapas del ciclo celular. Esto se debe principalmente a las limitaciones técnicas actuales, que dificultan la obtención de mediciones precisas de dichas interacciones dinámicas. Aquí, describimos un método mejorado que combina la recombinación específica del sitio con un protocolo eficiente de purificación de afinidad de un solo paso para aislar un locus de interés de un gen de copia única en su estado nativo de cromatina. El método permite el enriquecimiento robusto del locus diana sobre la cromatina genómica, lo que convierte a esta técnica en una estrategia eficaz para identificar y cuantificar las interacciones de proteínas de forma imparcial y sistemática, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Además de estos análisis de composición, la cromatina nativa purificada por este método probablemente refleje la situación in vivo con respecto al posicionamiento de los nucleosomas y las modificaciones de las histonas y, por lo tanto, es susceptible de análisis estructurales y bioquímicos adicionales de la cromatina derivada de prácticamente cualquier locus genómico en la levadura.

Introduction

La organización dinámica de los genomas eucariotas en cromatina compacta el ADN para que quepa dentro de los confines del núcleo, al tiempo que garantiza una dinámica suficiente para la expresión génica y la accesibilidad para los factores reguladores. En parte, esta versatilidad está mediada por el nucleosoma, la unidad básica de la cromatina, que comprende una partícula central con 147 pb de ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor del octámero^de histonas 1. El nucleosoma es una estructura altamente dinámica con respecto a su composición, con numerosas variantes de histonas y modificaciones postraduccionales (PTM) en las colas de histonas N- y C-terminales. Además, la cromatina eucariota interactúa con una multitud de otros componentes esenciales, como factores de transcripción, maquinaria de procesamiento de ADN y ARN, proteínas arquitectónicas, enzimas involucradas en la remodelación y modificación de la cromatina y moléculas de ARN asociadas con la cromatina. Estas maquinarias cruciales involucradas en la transcripción, replicación y reparación requieren acceso a la cromatina, que sirve como sustrato natural para estos procesos. En consecuencia, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a estas transacciones de ADN requiere una definición precisa de las alteraciones colectivas en la estructura de la cromatina en las regiones genómicas específicas donde estas maquinarias convergen y facilitan las reacciones biológicas.

A pesar de la identificación de numerosos factores de cromatina a través de estudios genéticos y de interacción proteína-proteína, la realización de análisis directos, imparciales y exhaustivos de las interacciones de la cromatina en sitios genómicos particulares ha seguido siendo un obstáculo importante ^2,3. Inicialmente, solo se pudieron aislar regiones muy abundantes del genoma (es decir, loci repetitivos) o plásmidos de copia múltiple en cantidades y pureza suficientes para la identificación por espectrometría de masas de las proteínas asociadas 4,5,6,7. Una serie de nuevos enfoques basados en la hibridación directa de sondas de captura con ADN cromatinizado, la biotinilación de proximidad mediante el sistema CRISPR-dCas9 o la unión de proteínas adaptadoras específicas de secuencia al locus de interés han comenzado a desentrañar el proteoma de loci de copia única de genomas de levaduras y mamíferos ^8,9,10. Sin embargo, todos estos métodos requieren reticulación de formaldehído para estabilizar las interacciones proteína-ADN y sonicación para solubilizar la cromatina para su posterior purificación. Juntas, ambas manipulaciones excluyen la posibilidad de estudios estructurales y funcionales posteriores de la cromatina purificada.

Para superar estas limitaciones, previamente ideamos una metodología que emplea la recombinación específica del sitio para extraer dominios cromosómicos específicos de la levadura^11,12. En esencia, la región genómica de interés está rodeada por sitios de reconocimiento (RS) para la R-recombinasa específica del sitio de Zygosaccharomyces rouxi, mientras que simultáneamente incorpora un grupo de tres sitios de unión al ADN para la proteína LexA represora transcripcional procariota (LexA) dentro de la misma región. Las células de levadura contienen un casete de expresión para la expresión simultánea de R-recombinasa y una proteína LexA fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad en tándem (TAP). Después de la inducción de la R-recombinasa, la enzima extirpa eficientemente la región objetivo del cromosoma en forma de un dominio circular de cromatina. Este dominio se puede purificar a través de la proteína adaptadora LexA-TAP, que se une a los sitios de unión del ADN LexA, así como a un soporte de afinidad. Este método se ha utilizado recientemente para aislar distintos dominios de cromatina que contienen orígenes de replicación seleccionados del cromosoma III¹³ de levadura.

Una de las principales ventajas de este enfoque ex vivo es que permite realizar análisis funcionales del material aislado. Por ejemplo, los dominios de origen de replicación purificados con este método pueden someterse a ensayos de replicación in vitro para evaluar la eficiencia de la cocción de origen en un tubo de ensayo a partir de plantillas de cromatina ensambladas in vivo nativas. En última instancia, la caracterización bioquímica y funcional del material aislado puede permitir la reconstitución de procesos nucleares utilizando proteínas purificadas junto con la plantilla de cromatina nativa. En resumen, esta metodología abre una vía emocionante en la investigación de la cromatina, ya que será posible seguir los cambios colectivos en la composición y la estructura de la cromatina de una región genómica específica que sufre una determinada transacción cromosómica.

Protocol

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de las soluciones, los búferes y los medios utilizados. 1. Construcción de cepas de levadura recombinante Para construir una cepa de levadura competente para la recombinación, transforme el plásmido K238 digerido por SbfI en una cepa de levadura con sit…

Representative Results

La purificación del dominio de cromatina ARS316 de ~1,4 kb fue mediada por la proteína adaptadora LexA-TAP expresada constitutivamente. Para que sirviera como control negativo, realizamos purificaciones utilizando una cepa isogénica que expresa LexA-TAP pero que no contiene sitios integrados de unión a RS y LexA. La Figura 3 ilustra el resultado del análisis de ADN de un experimento de purificación estándar realizado tanto en el control como en una cepa competente para la recombinaci?…

Discussion

La identificación de los factores y el panorama de la cromatina de una región genómica diana específica sigue planteando un reto importante en la investigación de la cromatina¹⁸. Este protocolo describe un sistema eficiente para extirpar y purificar específicamente distintos dominios de cromatina de los cromosomas de levadura. Hasta donde sabemos, la pureza y el rendimiento de esta purificación en un solo paso superan muchas de las limitaciones de los métodos de purificación de cromatina …

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid			Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA			Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Section 2 Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Section 6 Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate	Santa Cruz	Sc-29085	Section 2 Storage: Store at room temperature
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Section 3 Storage: Store at room temperature
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Section 3 Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	07604	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit	ThermoFisher	34580	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate	Merck	1.06579.1000	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher	15508013	Section 4 Storage: Store at 4 °C
Ethanol	Merck	100983	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Section 3 Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x)	BioLabs	B7024A	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Section Storage: Store at room temperature
Glycine	Carl Roth	.0079.4	Section 2 Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Section 4 Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Section 6 Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541	Section 4 Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system	ThermoFisher	18428-011	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)	SERVA	34140.03	Section 3 Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl)	Merck	K53710504142	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) )	Alfa Aesar	A11183	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium azide	Santa Cruz Biotechnology	sc-208393	Section 2 Storage: Store at -20 °C
Triethylamine	Sigma Aldrich	90340	Section 2 Storage: Store at room temperature
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Section 4 Storage: Store at room temperature
Yeast extract	BD (VWR)	212720	Section 3 Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )	Biomol	Y2016.5	Section 3 Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE	Sigma Aldrich	Y1376	Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)	NEB	R0105S	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Section 4 Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL)	NEB	P8112S	Section 5 Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads	Bioclone Inc.	FC-102	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Dry ice			Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Section 4
Microspin G-25 Columns	Cytiva	27-5325-01	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Parafilm	Merck	P7793	Section 4
Positive nylon membrane	Biozol	11MEMP0001	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody	Merck Millipore	06-719	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate	Invitrogen	G21234	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies	Sigma	I5006-100MG	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT			Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Section 7.1
Equipment
Coffee grinder	Gastroback	42601	Section 4
Dewar flask	NAL GENE	4150-2000	Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack	Invitrogen	12321D	Section 4, 5 and 6
Hybridization oven	Hybaid Mini10	Ri418	Section 2
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Section 4 and 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Section 7.1