用于评估肿瘤发生过程中抗原特异性 CD8+ T 细胞动力学的引流淋巴结转移模型
Summary
这里介绍的实验设计为淋巴结 （LN） 转移期间抗原特异性 CD8+ T 细胞的研究提供了一个有用的生殖模型，其中排除了旁观者 CD8+ T 细胞的扰动。
Abstract
来自引流淋巴结的肿瘤抗原特异性 CD8+ T 细胞在肿瘤发生过程中增强抗肿瘤免疫反应中变得越来越重要。然而，在许多情况下，癌细胞在进一步转移到远处器官之前在淋巴结中形成转移位点。局部和系统性 CD8+ T 细胞反应在多大程度上受到 LN 转移的影响尚不清楚。为此，我们建立了一个小鼠 LN 转移模型，该模型结合 B16F10-GP 黑色素瘤细胞系，该细胞系表达源自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 （LCMV）、糖蛋白 （GP） 和 P14 转基因小鼠的替代新抗原，这些小鼠携带 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子 H-2Db 呈递的 GP 衍生肽 GP33-41 特异性 T 细胞受体 （TCR）。该协议能够研究LN转移期间的抗原特异性CD8 + T细胞反应。在该方案中，C57BL/6J小鼠皮下植入B16F10-GP细胞，然后用幼稚P14细胞过继转移。当皮下肿瘤长到直径约5mm时，切除原发肿瘤，将B16F10-GP细胞直接注射到肿瘤引流淋巴结（TdLN）中。然后，监测CD8+ T细胞在LN转移过程中的动力学。总的来说，该模型提供了一种精确研究 LN 转移过程中抗原特异性 CD8+ T 细胞免疫反应的方法。
Introduction
癌症免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断 （ICB），彻底改变了癌症治疗1。ICB 阻断在肿瘤微环境 （TME） 中耗竭的 CD8+ T 细胞中高表达的抑制性免疫受体（如 PD-1、Tim-3、LAG-3 和 TIGIT），导致耗竭的 CD8+ T 细胞重新焕发活力2。考虑到耗竭的 CD8+ T 细胞的异质性，越来越多的证据表明，来源于外周的肿瘤特异性 CD8+ T 细胞，包括引流淋巴结 （dLN），但不在 TME 中，介导 ICB 3,4,5,6,7,8 的疗效。最近，TdLN 衍生的 TCF-1+TOX– 肿瘤特异性记忆 CD8+ T 细胞 （TdLN-TTSM） 被证实是 ICB 的真正应答者，它体现了传统记忆 T 细胞的多种功能特性，并且在 ICB 处理后可以进一步扩增和分化为后代耗竭细胞9。总而言之，这些发现证实了LN在增强抗肿瘤免疫力方面的重要性。
淋巴结通过提供结构基础和生物信号，在促进肿瘤特异性 CD8+ T 细胞的启动和激活方面发挥着关键作用10。在系统播散之前，几种类型的癌细胞经常播种前哨淋巴结（SLN，第一个引流原发肿瘤的 LN）11。SLN 转移的存在与人类癌症的不良预后有关，临床前模型表明 TdLN 中的肿瘤细胞可以通过淋巴管和淋巴结12、13、14、15 的血管扩散到远处器官。SLN 活检现在代表了指导许多实体瘤类型的后续治疗决策的标准程序，可以避免不必要的切除未受累的 LN16,17。即使对于受累的 LN，是否以及何时需要手术切除仍然存在争议，因为多项研究表明，与接受放疗或全身治疗而未进行区域 LN 切除的患者相比，切除区域 LN 并未改善总生存期18,19。一种解释是，患有微观疾病的转移性 LN （mLN） 可能保留了一些教育免疫细胞的能力并提供一些治疗益处。因此，阐明LN转移如何影响抗肿瘤免疫反应，尤其是TdLN-TTSM的特性和功能至关重要。
到目前为止，临床前和临床数据都揭示了 mLN20 的一些结构和细胞改变。然而，肿瘤特异性CD8+ T细胞在LN转移过程中的动态变化尚未被描述。因此，需要开发一个令人信服的 LN 转移模型以进行进一步研究。事实上，一些研究通过不同的方式报告了mLN小鼠模型14,21,22。例如，腋窝 LN 的自发转移是通过将 4T1 乳腺癌细胞植入乳腺脂肪垫22 进行的。在另一项研究中，Reticker-Flynn 等人通过连续接种从解离的 mLN 组织培养的肿瘤细胞（九轮）14，生成了从皮下原发肿瘤扩散到 LN 的高发生率黑色素瘤细胞系。另一种常用的模型是通过将肿瘤细胞注射到脚垫中制备的，转移位点将在腘窝LN22中形成。值得注意的是，很难评估干预的精确时间点，因为这些模型中的 LN 转移并不总是忠实的。
在本研究中，通过节点内注射 B16F10-GP 细胞23,24 建立了小鼠 LN 转移模型，该模型由 CRISPR/Cas9 介导的 LCMV 病毒糖蛋白 （GP） 基因序列插入 B16F10 细胞系9 的基因组中产生。然后，将这些小鼠与携带转基因 T 细胞受体 （TCR） 的 P14 细胞转移，特异性识别 H-2Db GP33-41 表位25,26，并且可以研究抗原特异性 CD8+ T 细胞在 LN 转移过程中的全身和局部动力学。我们的实验设计为免疫反应的研究提供了一个有用的模型，特别是LN转移过程中的抗原特异性CD8+ T细胞，排除了旁观者CD8+ T细胞的扰动。这些结果将影响临床治疗方案，即是否去除或保留 mLN，并为操纵 mLN 以实现最大治疗益处提供新的线索。
Protocol
Representative Results
Discussion
在肿瘤发生过程中，抗原呈递细胞 （APC） 吞噬肿瘤抗原并迁移到 TdLN，在那里它们引发 CD8+ T 细胞。启动和激活后，CD8+ T 细胞离开 TdLN 并浸润肿瘤以杀死肿瘤细胞10。通过 TdLN 切除术和阻断免疫细胞从淋巴器官退出的 FTY720 给药，多项研究表明 TdLN 在确保 PD-1/PD-L1 检查点治疗的疗效方面发挥着关键作用34,35。与此一致，…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家杰出青年科学基金（编号82122028至LX）、国家自然科学基金（编号82173094至LX）、崇庆自然科学基金（编号：2023NSCQ-BHX0087至SW）的支持。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referencias
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