Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

Summary

O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8⁺ circunstantes.

Abstract

As células T CD8⁺ antígeno-específicas tumorais provenientes da drenagem de linfonodos ganham importância acumulada na montagem da resposta imune antitumoral durante a tumorigênese. No entanto, em muitos casos, as células cancerosas formam loci metastáticos nos gânglios linfáticos antes de metastatizar para órgãos distantes. Até que ponto as respostas locais e sistemáticas de células T CD8⁺ foram influenciadas pela metástase de NL permanece obscura. Para isso, montamos um modelo de metástase de LN murino combinado com uma linhagem celular de melanoma B16F10-GP expressando o neoantígeno substituto derivado do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), glicoproteína (GP) e camundongos transgênicos P14 que abrigam receptores de células T (TCRs) específicos para o peptídeo GP_33-41 derivado da GP apresentado pela molécula H-2D^b do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I. Este protocolo permite o estudo da resposta antígeno-específica de células T CD8⁺ durante metástases de NL. Neste protocolo, camundongos C57BL/6J foram implantados subcutaneamente com células B16F10-GP, seguido de transferência adotiva com células P14 virgens. Quando o tumor subcutâneo crescia para aproximadamente 5 mm de diâmetro, o tumor primário era excisado e as células B16F10-GP eram injetadas diretamente no linfonodo de drenagem tumoral (TdLN). Em seguida, a dinâmica das células T CD8⁺ foi monitorada durante o processo de metástase do NL. Coletivamente, este modelo forneceu uma abordagem para investigar precisamente as respostas imunes de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases de NL.

Introduction

A imunoterapia do câncer, especialmente o bloqueio do ponto de verificação imune (ICB), revolucionou a terapia do câncer¹. O ICB bloqueia os imunorreceptores coinibitórios (como PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), que são altamente expressos em células T CD8⁺ esgotadas no microambiente tumoral (TME), levando ao revigoramento^{de células T} CD8⁺ esgotadas2. Considerando a heterogeneidade das células T CD8⁺ esgotadas, evidências acumuladas revelaram que células T CD8⁺ tumor-específicas derivadas da periferia, incluindo linfonodos drenantes (dLN), mas não na EMT, medeiam a eficácia do ICB3,4,5,6,7,8. Recentemente, confirmou-se que as células T CD8⁺ de memória específicas de TdLN TCF-1^{+TOX (}TdLN-T_TSM) são os verdadeiros respondedores ao ICB, que incorporam várias propriedades funcionais das células T de memória convencionais e podem expandir e diferenciar-se em células exaustas de progênie após o tratamento com ICB⁹. Em conjunto, esses achados corroboram a importância do NL na montagem da imunidade antitumoral.

O linfonodo funciona como um local crítico na facilitação do priming e ativação de células T CD8⁺ tumor-específicas, fornecendo base estrutural e sinais biológicos¹⁰. Vários tipos de células cancerosas frequentemente semeiam linfonodo sentinela (LS, o primeiro LN drenando um tumor primário) antes da disseminação^{sistemática11}. A presença de metástase no LS está associada a pior evolução no câncer humano e modelos pré-clínicos mostraram que as células tumorais no TdLN poderiam se espalhar para órgãos distantes através dos vasos linfáticos e sanguíneos do nódulo 12,13,14,15. A biópsia do LS representa agora um procedimento padrão para orientar decisões subsequentes de tratamento em muitos tipos de tumores sólidos, o que poderia evitar a ressecção desnecessária de NL não comprometido^16,17. Mesmo para o LN envolvido, permanece controverso se e quando a ressecção cirúrgica é necessária, pois vários estudos demonstraram que a remoção do NL regional não apresentou melhora na sobrevida global em comparação com aqueles que receberam radioterapia ou terapia sistêmica sem ressecção regional do NL ^18,19. Uma interpretação é que o LN metastático (mLN) com doença microscópica pode reter alguma capacidade de educar células imunes e fornecer alguns benefícios terapêuticos. Assim, é extremamente importante elucidar como a metástase de LN afeta a resposta imune antitumoral, especialmente as propriedades e funções da_TSM TdLN-T.

Até o momento, tanto os dados pré-clínicos quanto clínicos têm revelado algumas alterações estruturais e celulares no mLN²⁰. No entanto, as alterações dinâmicas das células T CD8⁺ tumor-específicas durante a metástase de NL não foram delineadas. Portanto, o desenvolvimento de um modelo convincente de metástase de NL é necessário para uma investigação mais aprofundada. De fato, vários estudos relataram modelos de camundongos mLN de diferentes maneiras 14,21,22. Por exemplo, metástases espontâneas em LNs axilares foram realizadas através do implante de células de câncer de mama 4T1 no coxim gorduroso^{mamário 22}. Em outro estudo, Reticker-Flynn e col. geraram linhagens celulares de melanoma com alta incidência de disseminação do tumor primário subcutâneo para LNs por meio da inoculação seriada de células tumorais cultivadas a partir de tecidos mLN dissociados (nove rodadas)¹⁴. Outro modelo comumente utilizado foi preparado pela injeção de células tumorais no coxim plantar e os loci metastáticos seriam formados no LN poplíteo²². Notadamente, é difícil avaliar os momentos precisos de intervenção, pois a metástase de NL nesses modelos nem sempre é fiel.

No presente estudo, um modelo metastático de LN murino foi estabelecido através da injeção intranodal de células B16F10-GP^23,24, geradas pela inserção mediada por CRISPR/Cas9 da sequência gênica da glicoproteína (GP) do vírus LCMV no genoma da linhagem celular B16F10 9. Em seguida, esses camundongos foram transferidos com células P14 que abrigam receptores transgênicos de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o epítopo H-2D^b GP_33-41 ^25,26 e a dinâmica sistêmica e local de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases de NL pôde ser investigada. Nosso desenho experimental fornece um modelo útil para o estudo das respostas imunes, especialmente das células T CD8⁺ antígeno-específicas durante a metástase do LN, o que exclui a perturbação das células T CD8⁺ circunstantes. Esses resultados afetariam as opções de tratamento clínico de remover ou reter o mLN e lançariam uma nova luz sobre a manipulação do mLN para alcançar o máximo de benefícios terapêuticos.

Protocol

Os camundongos C57BL/6J (referidos a camundongos B6) e os camundongos transgênicos P14 virgens 9,27 utilizados tinham de 6 a 10 semanas de idade, pesando 18-22 g. Homens e mulheres foram incluídos sem randomização ou cegamento. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Qingdao. 1. Preparação do meio e dos reage…

Representative Results

O diagrama esquemático deste desenho experimental é mostrado na Figura 1A. Um total de 5 x 105 células B16F10-GP em 100 μL de PBS foram implantadas por via subcutânea (s.c.) na região inguinal bilateral de camundongos CD45.2 C57BL/6J. Após 7 dias, esses camundongos portadores de tumor foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com 4 mg de CTX, seguido pela transferência adotiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 através de injeção intravenosa (i.v.) d…

Discussion

Durante a tumorigênese, as células apresentadoras de antígenos (APCs) engolem antígenos tumorais e migram para TdLN, onde formam células T CD8⁺. Após priming e ativação, as células T CD8⁺ deixam o TdLN e infiltram o tumor para matar as células tumorais¹⁰. Através da ressecção de TdLN e da administração de FTY720, que bloqueiam a saída de células imunes dos órgãos linfoides, vários estudos têm demonstrado o papel fundamental do TdLN em garantir a eficácia…

Materials

1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml