חיקוי שיטת הגלגול של דינג על פגיעת שריר הנגרמת על ידי נוטקסין בחולדות

Summary

פרוטוקול זה מתאר מכשיר פשוט המחקה את שיטת הגלגול של דינג, מבסס מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד, ומשתמש בצביעת המטוקסילין-אאוזין כדי לבחון את הפתולוגיה של רקמות פגועות ובדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים כדי לזהות שינויים בסמני נזק בסרום.

Abstract

שיטת הגלגול של דינג היא אחת המניפולציות הנפוצות ביותר במרפאות עיסוי סיני מסורתי (Tuina) ואחת המניפולציות העכשוויות המשפיעות ביותר בסין. היא מבוססת על שיטת הגלגול המסורתית הנפוצה בז’אנר הזן באצבע אחת ונקראת שיטת הגלגול של דינג. בשל השפעותיה האנטי דלקתיות ומעודדות זרימת הדם, לשיטת הגלגול של דינג יש השפעות טיפוליות טובות על מיופתיה. בגלל שטח הכוח הגדול המופעל על עור האדם, שיטת הגלגול של דינג מאתגרת לביצוע על חיות ניסוי עם אזורי עור קטנים, כגון חולדות וארנבות. בנוסף, הכוח של טווינה המיושם על גוף האדם שונה מזה המיושם על חיות ניסוי, ולכן זה יכול לקרות כי הכוח הוא גבוה מדי או נמוך מדי כדי להשיג את ההשפעה הטיפולית של Tuina במהלך הניסוי. ניסוי זה נועד ליצור מכשיר עיסוי פשוט המתאים לחולדות בהתבסס על פרמטרי מניפולציית הגלגול של דינג (חוזק, תדירות, משך טווינה). המכשיר יכול לתקנן מניפולציות בניסויים בבעלי חיים ולהפחית את השונות בכוח טווינא המופעל על בעלי חיים שונים בשל גורמים סובייקטיביים. מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד כתוצאה מ-notexin-inducis הוקם, וסמני פגיעה בפלזמה קריאטין קינאז (CK) וחלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3) שימשו להערכת ההשפעה הטיפולית של Tuina על פגיעה בשרירי השלד. התוצאות הראו כי מעסה Tuina זה יכול להפחית את רמות הביטוי של CK ו- FABP3 ולהאט את מידת הפגיעה בשרירי השלד. לכן, מכשיר העיסוי Tuina המתואר כאן, המחקה את שיטת הגלגול של דינג, תורם לסטנדרטיזציה של מניפולציית Tuina במחקר ניסיוני ומסייע רבות למחקר הבא על המנגנון המולקולרי של Tuina למיופתיה.

Introduction

פגיעות שרירים הן פציעות טראומטיות שכיחות בחיי הקליניקה ובחיי היומיום, הנגרמות כתוצאה ממכות חיצוניות (חבלות) או ממאמץ יתר כרוני של סיבי שריר (מתחים) וכו’, וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של השרירים ולכאבים, ואף משפיעים באופן חמור על איכות חייו של המטופל¹. התחלת שיקום מוקדם ככל האפשר לאחר פציעת מאמץ חריפה היא המפתח לקיצור זמן החזרה לספורט² ולהפחתת כאב ^3,4. ברפואה המערבית המודרנית, עזרה ראשונה קלינית לפציעות שרירים עוקבת אחר עקרונות המנוחה, הקרח, הדחיסה וההגבהה (RICE) כדי לעצור דימום מזיק לרקמת השריר⁵ ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות להקלה על כאב⁶. גילוי טיפולים חדשניים כגון אקסוזומים⁷ והנדסת רקמות⁸ הפכו לאסטרטגיות טיפול פוטנציאליות במחלות שרירי שלד, המפצות על חסרונותיהם של טיפולים תרופתיים קודמים. עם זאת, זה יכול גם לייקר את עלות הטיפול בחולים, לשים אותם תחת לחץ כלכלי עצום⁹. לכן, טיפולים אלטרנטיביים ומשלימים מומלצים לטיפול בבעיות שרירים ושלד¹⁰. טווינה נמצאת בשימוש קליני נרחב בסין כשיטה רפואית מסורתית והיא פופולרית בקרב חולים בשל יעילותה ופחות תופעות לוואי. טיפול טווינא בהפרעות שרירים ושלד יכול להקל על הכאב ולשפר את התפקוד^11,12,13. מר דינג ג’יפנג, מתרגל טואינה מפורסם משנחאי, ייסד את שיטת הרול¹⁴ של דינג. זוהי טכניקת גלגול וריסוק ייחודית עם שטח כוח גדול, כוח אחיד ועדין, וחדירה אינטנסיבית.

מודלים שונים של בעלי חיים מבוססים על אטיולוגיות שונות. יש להם יתרונות וחסרונות, ולבחירת מודלים נכונים ומתאימים של בעלי חיים יש משמעות רבה לניסויים בסיסיים, המסייעים להבין את מסלולי האיתות התאיים והמולקולריים של התחדשות ותיקון לאחר פגיעה בשרירי השלד כדי לפתח טיפולים חדשים לטיפול במחלות שרירי השלד. מודלים כימיים של פגיעה בשרירים נמצאים בשימוש נרחב, עם זריקות של שרירי השלד הגורמות לנמק מיופייבר ומייצרות אזורים מחודשים שיכולים להתחדש ביעילות תוך שבועיים¹⁵. גם נוטקסין וגם בופיוואקאין עלולים לגרום נזק לשרירים. עם זאת, נוטקסין יכול לגרום נזק מיוטוקסי חמור יותר לשרירי השלד מאשר bupivacaine, וההתאוששות התפקודית הטבעית איטית יחסית¹⁶. הזרקה תוך שרירית של תרופות לא רק לוקחת פחות זמן, אלא גם יש לה השפעות מבוקרות והיקף הנזק לשרירי השלד. בקרה ניתנת לכימות זו הופכת את היציקה המוצלחת לפחות קשה^15,17.

תגובה דלקתית היא תגובה ביולוגית חיונית שנחקרה בהרחבה בהקשר של מיופתיה^18,19. בשלבים המוקדמים של פגיעה בשרירי השלד, נמק מיופייבר משבש את הומאוסטזיס השריר המקומי, ותאי דלקת רבים חודרים לאתר הפציעה ומפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים¹⁹. קריאטין קינאז (CK) הוא סמן ביולוגי מסורתי בסרום להערכת פגיעה בשרירי השלד. עם זאת, הוא חסר ספציפיות רקמות²⁰ ורגישות²¹, מה שמגביל את יכולתו להעריך את היקף הנזק לשרירים הנגרם על ידי תרופות ולדווח בעקיפין על מידת התאוששות השרירים לאחר פציעה. סמנים ביולוגיים חדשניים, כולל חלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3), הראו לאחרונה ספציפיות ורגישות גבוהות יחסית לרקמות במודלים של מכרסמים של פגיעה בשרירי השלד. FABP3 היא משפחה של חלבונים קושרים המתבטאים בעיקר בתאי שריר הלב והשלד ומעורבים בחילוף חומרים, הובלה ואיתות של חומצות שומן²². לכן, בחרנו בשילוב של שני סמנים ביולוגיים, CK ו- FABP3, כדי להעריך את מידת הנזק לשרירי השלד הנגרם על ידי נוטקסין ואת ההתאוששות לאחר הטיפול.

במכרסמים השרירים רדודים, ושטח העור קטן, מה שקובע גם שהפרמטרים השונים של עיסוי במכרסמים לא יהיו זהים לאלה שבבני אדם, כמו בטיפול באמצעות בעלי חיים, המעסה צריך לטפל בהם בפחות כוח בשיטת הגלגול של דינג, וייתכן שלא יתרום להפעלת טכניקה זו בשל גודלו הקטן של האזור הפגוע, מה שיכול בסופו של דבר להוביל לירידה ביעילות העיסוי. לכן, הניסוי השתמש במעסה המתגלגל שנעשה בבית, התואם את המאפיינים של שיטת הגלגול של דינג, כדי להתערב ולהעריך את ההשפעה הטיפולית של מודל הפגיעה בשרירי השלד בחולדות, המסייע לתקנן את הפרמטרים של טווינה במחקרים ניסיוניים בבעלי חיים על מנת לחקור לעומק את מנגנון הפעולה המולקולרי של טווינה, שיטת טיפול ברפואה סינית מסורתית, במחלות שרירים ושלד.

Protocol

הליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדית באוניברסיטת הונאן לרפואה סינית. 1. הרכבת המעסה המתגלגל בחרו מכשיר עיסוי המורכב מגלגלת גומי, מחזיק מזלגות, קפיץ, מבולבל גבול, סד כוונון, בורג וידית אקרילית (איור 1). ודאו שגלגלת הגו…

Representative Results

על מנת לבחון את התכונות המורפולוגיות של שריר השלד של חולדה לאחר פציעה, שריר הגסטרוקנמיוס הוכתם בהמטוקסילין ובאאוזין, והתמונות המוכתמות נקראו באמצעות תוכנת ניתוח כמתואר בפרוטוקול עבור 8 חולדות לקבוצה. בחולדות עם פגיעה בשריר הגסטרוקנמיוס שנגרמה על ידי נוטקסין (קבוצת NTX), תאי שריר רבים נקרעו…

Discussion

כאן, תיארנו פרוטוקול לטיפול בטווינה בפגיעה בשרירי השלד בחולדות ולאחר מכן ניתחנו את מידת הפגיעה בשרירי השלד לאחר הטיפול כדי לאמת את יעילות השיטה. יש לציין כי מודלים של פגיעות בשרירי השלד של חולדות, כולל, אך לא רק, השראת תרופות (notexin, bupivacaine)16, קונטוזיה קהה ²⁶, ריסוק 27 ואיסכמיה-רפרפו…

Materials

1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ