Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.
Le complicanze cerebrovascolari, tra cui l’edema cerebrale e l’ictus ischemico ed emorragico, costituiscono la principale causa di mortalità materna associata alla preeclampsia. I meccanismi alla base di queste complicanze cerebrovascolari rimangono poco chiari. Tuttavia, sono collegati alla disfunzione placentare e all’interruzione della barriera emato-encefalica (BBB). Tuttavia, la connessione tra questi due organi distanti è ancora in fase di determinazione. Prove crescenti suggeriscono che la placenta rilascia molecole di segnalazione, comprese le vescicole extracellulari, nella circolazione materna. Le vescicole extracellulari sono classificate in base alle loro dimensioni, con piccole vescicole extracellulari (sEV di diametro inferiore a 200 nm) considerate particelle di segnalazione critiche sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Nella preeclampsia, c’è un aumento del numero di sEV circolanti nella circolazione materna, la cui funzione di segnalazione non è ben compresa. Le sEV placentari rilasciate nella preeclampsia o dalle placente della gravidanza normale esposte all’ipossia inducono disfunzione endoteliale cerebrale e interruzione della BBB. In questo protocollo, valutiamo se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la BBB in vivo.
Circa il 70% dei decessi materni dovuti a preeclampsia, una sindrome gravidica ipertensiva caratterizzata da alterazione dei processi di placentazione, disfunzione endoteliale sistemica maternae, nei casi più gravi, insufficienza multiorgano 1,2, sono associati a complicanze cerebrovascolari acute 3,4. La maggior parte dei decessi materni si verifica nei paesi a basso e medio reddito5. Tuttavia, i meccanismi sottostanti non sono ancora chiari nonostante la rilevanza clinica ed epidemiologica delle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia.
D’altra parte, le vescicole extracellulari (EV) (diametro ~30-400 nm) sono mediatori essenziali della comunicazione intercellulare tra tessuti e organi, compresa l’interazione materno-placentare6. Oltre alle proteine e ai lipidi sulla superficie esterna, le vescicole extracellulari trasportano il carico all’interno (proteine, RNA e lipidi). Le vescicole extracellulari possono essere classificate in (1) esosomi (diametro ~50-150 nm, chiamati anche piccole vescicole extracellulari (sEV)), (2) vescicole extracellulari medie/grandi e (3) corpi apoptotici, che differiscono per dimensioni, biogenesi, contenuto e potenziale funzione di segnalazione. La composizione delle vescicole extracellulari è determinata dalle cellule da cui hanno origine e dal tipo di malattia7. Le vescicole extracellulari derivate dal sinciziotrofoblasto esprimono la fosfatasi alcalina placentare (PLAP)8,9, che rileva le piccole vescicole extracellulari circolanti derivate dalla placenta (PDsEV) in gravidanza. Inoltre, il PLAP aiuta a discernere i cambiamenti nel carico di PDsEVs e i loro effetti nella preeclampsia rispetto alle gravidanze normotese 10,11,12,13,14,15.
La placenta è stata riconosciuta come il componente necessario nella fisiopatologia della preeclampsia16 o delle complicanze cerebrali associate a questa malattia 17,18,19. Tuttavia, non si sa come questo organo distante possa indurre alterazioni nella circolazione cerebrale. Poiché le sEV svolgono un ruolo fondamentale nella comunicazione cellula-cellula grazie alla loro capacità di trasferire componenti bioattivi dalle cellule donatrici a quelle riceventi 6,20,21, un numero crescente di studi ha associato le sEV placentari alla generazione di disfunzione endoteliale materna 21,22,23,24, comprese le cellule endoteliali cerebrali 25,26nelle donne con preeclampsia. Pertanto, la compromissione della funzione endoteliale cerebrale può portare all’interruzione della barriera emato-encefalica (BBB), una componente critica nelle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia 3,27.
Tuttavia, i risultati preclinici che hanno utilizzato vasi cerebrali di ratto esposti al siero di donne con preeclampsia28 o cellule endoteliali cerebrali umane esposte al plasma di donne con preeclampsia29 hanno riportato che i fattori circolanti inducono l’interruzione della BBB. Nonostante diversi candidati con il potenziale di danneggiare la BBB presente nella circolazione materna durante la preeclampsia, come livelli elevati di citochine proinfiammatorie (cioè il fattore di necrosi tumorale)18,28 o regolatori vascolari (cioè il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF))29,30,31, o molecole ossidative come le lipoproteine ossidate (oxo-LDL)32,33, tra gli altri34, nessuno di essi stabilisce una connessione diretta tra la placenta e la BBB. Recentemente, le sEV isolate da placente ipossiche hanno mostrato la capacità di interrompere la BBB in topi femmina non gravidi25. Poiché le sEV placentari possono trasportare la maggior parte dei fattori circolanti elencati con la capacità di interrompere la BBB, le sEV sono considerate candidati adatti per collegare la placenta lesa, essere il vettore di fattori circolanti dannosi e interrompere la BBB nella preeclampsia.
Questo protocollo ci permette di indagare se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche possono interrompere la BBB in topi femmine non gravidi come proxy per comprendere la fisiopatologia delle complicanze cerebrali durante la preeclampsia.
Questo studio svela nuove intuizioni sul potenziale danno derivante dalle sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche sulla rottura della barriera emato-encefalica dei roditori. Il meccanismo patologico comporta una riduzione di CLND-5 nella regione cerebrale posteriore25.
Indagini precedenti hanno rivelato che le sEV plasmatiche di individui con preeclampsia inducono disfunzione endoteliale in vari organi utilizzando modelli in vitro <…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare i ricercatori di GRIVAS Health per il loro prezioso contributo. Inoltre, le ostetriche e il personale clinico del Servizio di Ostetricia e Ginecologia appartengono all’Hospital de Chillan, in Cile. Fondata da Fondecyt Regular 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |