Оценка микроархитектуры трабекулярной кости на мышиной модели остеопороза
Summary
Данный протокол представляет собой экономичный и эффективный метод количественной оценки микроархитектуры костной ткани на мышиной модели остеопороза путем сочетания методов окрашивания гематоксилин-эозином (ГЭ) и микрокомпьютерной томографии (Микро-КТ).
Abstract
Микроструктура кости относится к расположению и качеству костной ткани на микроскопическом уровне. Понимание костной микроструктуры скелета имеет решающее значение для понимания патофизиологии остеопороза и улучшения его лечения. Однако работа с образцами костей может быть сложной задачей из-за их твердых и плотных свойств. Во-вторых, специализированное программное обеспечение затрудняет обработку и анализ изображений. В этом протоколе мы представляем экономичное и простое в использовании решение для анализа микроструктуры трабекулярной кости. Подробно описаны шаги и меры предосторожности. Микро-КТ — это метод неразрушающей трехмерной (3D) визуализации, который позволяет получать изображения структуры трабекулярной кости с высоким разрешением. Он позволяет объективно и количественно оценить качество костной ткани, поэтому он считается золотым стандартом оценки качества костной ткани. Тем не менее, гистоморфометрия остается незаменимой, поскольку она предлагает важнейшие параметры на клеточном уровне, преодолевая разрыв между двумерной (2D) и 3D-оценкой образцов костей. Что касается гистологических методов, мы выбрали декальцинацию костной ткани, а затем традиционное введение парафина. Таким образом, сочетание этих двух методов может дать более полную и точную информацию о микроструктуре кости.
Introduction
Остеопороз является распространенным метаболическим заболеванием костей, особенно среди пожилых людей, и связан с повышенным риском хрупких переломов. По мере того, как остеопороз становится все более распространеннымв Китае1, будет расти спрос на изучение костных структур мелких животных 2,3. Предыдущие методы измерения потери костной массы основываются на результатах двумерной двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Однако при этом не учитываются изменения в архитектурной микроструктуре трабекулярной кости, которая является ключевымфактором для прочности скелета. Микроструктура кости влияет на ее прочность, жесткость и устойчивость к изломам. Сравнивая микроархитектуру костной ткани в норме и при патологии, можно выявить изменения морфологии, структуры и функции костной ткани, вызванные остеопорозом. Эта информация способствует пониманию развития остеопороза и его связи с другими заболеваниями.
Микрокомпьютерная томография (Микро-КТ) в последнее время стала популярным методом оценки морфологии кости, где она может предоставить точные и исчерпывающие данные о структуре и параметрах плотности кости, таких как объемная доля кости, толщина и разделение 5,6. В то же время на результаты микро-КТ может влиять аналитическое программное обеспечение7. Различные методы получения, оценки и составления отчетов изображений используются различными коммерческими системами микро-КТ. Это несоответствие затрудняет сравнение и интерпретацию результатов, полученных в различных исследованиях5. Кроме того, в настоящее время она не может заменить костную гистоморфометрию в предоставлении исследователям информации о параметрах на клеточном уровне в костной системе8. Между тем, гистологические методы позволяют непосредственно наблюдать и измерять микроскопическую морфологию кости. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ) является распространенным методом окрашивания, используемым в гистологии для визуализации общей структуры клеток и тканей. Применяется для выявления наличия костной ткани и ее микроархитектуры.
В данной статье используется микро-КТ в сочетании с техникой среза тканей (окрашивание гематоксилин-эозином [HE]) для сбора изображений костной ткани и проведения количественного анализа трабекулярной кости для оценки изменений микроструктуры кости в мышиной модели остеопороза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Остеопороз может приводить к частым переломам, которые являются дорогостоящими, могут вызывать боль, инвалидность или даже смерть и серьезно влиять на качество жизни пациентов20. На протяжении многих лет модель овариоэктомии была признана одним из стандартных методов изу?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Управлением традиционной китайской медицины провинции Сычуань (2021YJ0175) и Инновационным проектом аспирантуры Школы клинической медицины (LCYJSKT2023-11) Университета традиционной китайской медицины Чэнду.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referencias
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
