Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis
Summary
Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).
Abstract
La microestructura ósea se refiere a la disposición y calidad del tejido óseo a nivel microscópico. Comprender la microestructura ósea del esqueleto es crucial para comprender la fisiopatología de la osteoporosis y mejorar su tratamiento. Sin embargo, el manejo de muestras óseas puede ser complejo debido a sus propiedades duras y densas. En segundo lugar, el software especializado dificulta el procesamiento y análisis de imágenes. En este protocolo, presentamos una solución rentable y fácil de usar para el análisis de la microestructura ósea trabecular. Se proporcionan pasos y precauciones detallados. La micro-TC es una técnica de imagen tridimensional (3D) no destructiva que proporciona imágenes de alta resolución de la estructura ósea trabecular. Permite la evaluación objetiva y cuantitativa de la calidad ósea, por lo que es ampliamente considerado como el método de referencia para la evaluación de la calidad ósea. Sin embargo, la histomorfometría sigue siendo indispensable, ya que ofrece parámetros cruciales a nivel celular, cerrando la brecha entre las evaluaciones bidimensionales (2D) y 3D de las muestras óseas. En cuanto a las técnicas histológicas, se optó por descalcificar el tejido óseo y posteriormente realizar la inclusión tradicional en parafina. En resumen, la combinación de estos dos métodos puede proporcionar información más completa y precisa sobre la microestructura ósea.
Introduction
La osteoporosis es una enfermedad ósea metabólica prevalente, especialmente entre los ancianos, y se asocia con un mayor riesgo de fracturas por fragilidad. A medida que la osteoporosis se vuelve más común en China1, habrá una creciente demanda de estudio de las estructuras óseas de animales pequeños 2,3. Los métodos anteriores para medir la pérdida ósea se basan en los resultados de la absorciometría bidimensional de rayos X de doble energía. Sin embargo, esto no capta los cambios en la microestructura arquitectónica del hueso trabecular, que es un factor clave para la resistencia esquelética4. La microestructura del hueso afecta su fuerza, rigidez y resistencia a las fracturas. Al comparar la microarquitectura ósea en estados normales y patológicos, se pueden identificar los cambios en la morfología, estructura y función del tejido óseo causados por la osteoporosis. Esta información contribuye a la comprensión del desarrollo de la osteoporosis y su asociación con otras enfermedades.
Las imágenes de microtomografía computarizada (Micro-TC) se han convertido recientemente en una técnica popular para la evaluación de la morfología ósea, donde pueden proporcionar datos precisos y completos sobre la estructura ósea y los parámetros de densidad, como la fracción de volumen óseo, el grosor y la separación 5,6. Al mismo tiempo, los resultados de Micro-CT pueden verse afectados por el software de análisis7. Varios sistemas comerciales de Micro-CT utilizan diferentes métodos de adquisición, evaluación e informes de imágenes. Esta inconsistencia dificulta la comparación e interpretación de los resultados reportados por diferentes estudios5. Además, actualmente no puede reemplazar la histomorfometría ósea para proporcionar a los investigadores información sobre los parámetros a nivel celular en el sistema esquelético8. Por su parte, las técnicas histológicas permiten la observación y medición directa de la morfología microscópica del hueso. La tinción con hematoxilina y eosina (HE) es una técnica de tinción común que se utiliza en histología para visualizar la estructura general de las células y los tejidos. Se utiliza para identificar la presencia de tejido óseo y su microarquitectura.
En este artículo se utiliza la microtomografía computarizada combinada con la técnica de corte de tejido (tinción de hematoxilina-eosina [HE]) para recoger imágenes de tejido óseo y realizar un análisis cuantitativo del hueso trabecular para evaluar los cambios de la microestructura ósea en un modelo de ratón con osteoporosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
La osteoporosis puede conducir a fracturas frecuentes, que son costosas, pueden causar dolor, discapacidad o incluso la muerte, y afectar seriamente la calidad de vida de los pacientes20. A lo largo de los años, el modelo de ovariectomía ha sido reconocido como uno de los métodos estándar para el estudio de la osteoporosis21. El modelo animal preclínico más común para la osteoporosis es la rata ovariectomizada (OVX). A pesar de ello, la mayoría de las investigacione…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan (2021YJ0175) y el Proyecto de Innovación de Investigación de Posgrado de la Facultad de Medicina Clínica (LCYJSKT2023-11) de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referencias
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