Summary
التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE) هو تقنية لتطور البروتين السريع والقوي. تسمح الروبوتات بتوازي التجارب والمراقبة في الوقت الفعلي والتحكم في التغذية الراجعة.
Abstract
تعمل تقنيات التطور المعجلة بالروبوتات على تحسين موثوقية وسرعة التطور باستخدام التحكم في التغذية المرتدة ، مما يحسن نتائج تجارب تطور البروتين والكائن الحي. في هذه المقالة ، نقدم دليلا لإعداد الأجهزة والبرامج اللازمة لتنفيذ التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات (PRANCE). يجمع PRANCE بين التطور الجزيئي السريع القائم على العاثيات والقدرة على إجراء مئات تجارب التطور المستقلة التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة في وقت واحد. سوف تصف هذه الورقة متطلبات الأجهزة والإعداد ل PRANCE ، بما في ذلك أداة معالجة السوائل ، وقارئ الألواح ، والمضخات المساعدة ، والسخانات ، والحاويات المطبوعة 3D. وصفنا كيفية تكوين روبوت معالجة السوائل ليكون متوافقا مع البرامج مفتوحة المصدر المستندة إلى Python. أخيرا ، نقدم اقتراحات لأول تجربتين يمكن إجراؤهما باستخدام نظام PRANCE الذي تم إنشاؤه حديثا والذي يمارس قدراته ويتحقق من أن النظام جاهز لإجراء تطور متعدد الإرسال. يهدف هذا الدليل إلى أن يكون بمثابة كتيب للتنقل في إعداد المعدات الكبيرة المرتبطة بإجراء التطور المتسارع للروبوتات.
Introduction
PRANCE هو مزيج من اثنين من تقنيات التطور الموجهة القوية. الأول هو PACE1 ، وهي تقنية جزيئية تجمع بين جولات تنويع الجينات واختيارها بدورة الحياة السريعة للبكتيريا M13 ، مما يتيح حدوث جولات سريعة من التطور بشكل مستمر في ثقافة العاثيات السائلة. هذا الاختيار مدفوع باستخدام دائرة جينية مشفرة بالبلازميد تجمع بين وظيفة البروتين المتطور والتعبير عن pIII ، بروتين معطف الذيل M13 ، وهو ضروري لانتشار العاثيات ، وهذا موضح في الشكل 1. على المستوى التجريبي ، يسمح التخفيف المستمر لثقافة العاثيات السائلة بالاختيار المستمر. وبالتالي يمكن تعديل صرامة الاختيار على مستوى دائرة الجينات وكذلك على المستوى التجريبي من خلال التحكم في معدل تخفيف ثقافة العاثيات. لذلك يمكن تطبيق PACE على أي تحد هندسي للجزيئات الحيوية يوجد له مستشعر جزيئي يمكنه اكتشاف النشاط المطلوب في بكتيريا الإشريكية القولونية للحث على التعبير عن pIII. تشمل التطبيقات تطور ارتباط البروتينوالبروتين 2،3،4 ، وربط البروتين والحمض النووي5 ، وذوبان البروتين6 ، والعديد من الوظائف الأنزيمية المحددة7. والثاني هو التطورالمتسارع بالروبوتات 8,9 ، والذي يستخدم وحدة تحكم في التغذية المرتدة للقضاء على وضعين شائعين للفشل في التطور الموجه: الانقراض ، الذي يحدث عندما تكون البيئة صارمة للغاية ، ونقص التطور ، والذي يحدث عندما تكون البيئة متساهلة للغاية. على عكس المرور التسلسلي للعاثيات كما هو الحال في PANCE (التطور غير المستمر بمساعدة العاثيات)7،10 ، يتضمن التطور "شبه المستمر" المتسارع بالروبوتات سحب سريع يحافظ على الثقافات في مرحلة منتصف السجل ، مما يسمح للسكان بتجربة دورات مستمرة من العدوى والتكاثر. عندما يتم استخدام هاتين التقنيتين معا ، يشار إليهما باسم PRANCE ، للتطور شبه المستمر بمساعدة العاثياتوالروبوتات 8 ، والذي يتيح التطور المستمر القوي والمضاعف والسريع. تم استخدام PRANCE لتطوير البلمرة ، tRNAs ، وتوليفات amino-acyl tRNA والقيام بالتحكم في التغذية المرتدة خلال تلك التطورات لتحسين سرعتها وموثوقيتها8.
هناك العديد من التفاصيل حول إعداد الأجهزة والبرامج ل PRANCE التي تمكن من استخدام البكتيريا على روبوت معالجة السوائل. بدلا من استخدام البرامج الافتراضية التي توفرها الشركة المصنعة للروبوت ، نستخدم حزمة برامج مفتوحة المصدر قائمة على Python11 ، والتي تتيح التنفيذ السريع والمتزامن وبالتالي القدرة على الحفاظ على المفاعلات الحيوية شبه المستمرة في مرحلة منتصف السجل. يمكن تمديد وقت عدم تدخل الباحث إلى عدة أيام من خلال وجود العديد من المكونات الموجودة على سطح السفينة بشكل روتيني ، ويتم تحقيق ذلك من خلال التحكم التلقائي في المضخات التي يمكنها تبييض هذه المكونات وشطفها. يمكن القضاء على التلوث المتبادل للعاثيات عن طريق استخدام روبوت مناولة السوائل الذي لا يستخدم نصائح ملائمة للقوة وتعديل دقيق لإعدادات معالجة السوائل.
Protocol
1. إعداد الأجهزة
ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة على مكونات الأجهزة لنظام PRANCE والشكل 3 للحصول على صور لهذه المكونات المجمعة فعليا.
- احصل على الأجهزة الأساسية لنظام PRANCE ، بما في ذلك أداة معالجة السوائل وقارئ الألواح والمضخات المساعدة.
ملاحظة: تم تنفيذ جميع أنظمة PRANCE حتى الآن على أدوات مناولة السوائل المتوسطة إلى الكبيرة المجهزة بأذرع سحب ذات 8 قنوات وقابلة للعنونة بشكل فردي ، وذراع ماصة أحادي المكبس 96 طرفا ، وقابض آلي للألواح المتحركة ، ومحطة غسيل متكاملة لتعقيم الأطراف ، وقارئ لوحة متكامل قادر على قياسات الامتصاص والتألق. - قم بتكوين استراتيجيات التسخين اعتمادا على طراز وميزات روبوت معالجة السوائل. استخدم حامل لوحة ساخنة أو تحكم في المناخ بوساطة سخان.
- قم بإنشاء محطة غسيل أطراف للسماح بإعادة استخدام الأطراف.
ملاحظة: حتى الآن ، استخدمت أنظمة PRANCE محطات غسيل جاهزة ، على الرغم من أنه ، من حيث المبدأ ، يمكن بسهولة بناء هذا المكون من مكونات منخفضة التكلفة. - إنشاء مصدر للثقافة البكتيرية التي يتم الحفاظ عليها في مرحلة السجل من خلال إنشاء مفاعل حيوي في الوقت الفعلي يعمل عند 37 درجة مئوية ككيميائي / توربيدوستات. بدلا من ذلك ، توقف عن مزرعة بكتيرية في طور لوغاريتمي بحجم لا يقل عن 1 لتر نمت مسبقا عند 37 درجة مئوية في الطور اللوغاريتمي (OD600 بين 0.25 و 0.45) عند 4 درجات مئوية في ثلاجة قريبة. تأكد من تقليب المستنبت، سواء كانت مبردة أو دافئة، بانتظام باستخدام لوحة شاكر أو لوحة تحريك لمنع الترسيب.
- قم بتكوين المضخات المفضلة للتكامل الآلي مع البرامج وبرامج التشغيل الضرورية. تنفيذ البرنامج لتمكين المضخات من توصيل كميات محددة من السائل في حدود 10-100 مل.
ملاحظة: راجع جدول المواد للمضخات المستخدمة في هذا التنفيذ وموقع الشركة المصنعة على الويب للحصول على البرامج المستخدمة لتشغيل هذه المضخات والوثائق حول كيفية تكوينها. يتم توفير مثل هذه البرامج للمضخات المستخدمة في إعداد PRANCE الموضحة في هذه المخطوطة مفتوحة المصدر في مستودع GitHub التالي https://github.com/dgretton/std-96-pace يتطلب PRANCE على الأقل مشعبا من ثلاث مضخات قادر على ضخ ثلاث قنوات منفصلة (توصيل البكتيريا إلى الخزان البكتيري ، وتوصيل المبيض إلى الخزان البكتيري ، وتصريف الخزان البكتيري إلى النفايات) ، مع معايرة سرعة كل منها والتحكم فيها بشكل مستقل. في الماضي ، استخدم الناس مضخات خزانات الأسماك ومصفوفات مضخات الزراعة المائية ، على الرغم من أنه ، من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أي مضخة تمعجية يمكن التحكم فيها بواسطة الثعبان. تشمل الوظائف الأساسية القدرة على استخدام قابض روبوت لنقل اللوحات داخل القارئ أو خارجه ، لبدء قياس قارئ اللوحة ، والوصول إلى القياسات. - 3D-طباعة مكونات السطح المخصصة المطلوبة لنظام PRANCE ، بما في ذلك ، على الأقل ، مشعب الخزان / التوزيع البكتيري ("الهراء") ، كما هو موجود في الملف التكميلي 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). قم بتأمين هذه الحاويات على سطح السفينة ومعايرة مواقعها باستخدام برنامج روبوت مناولة السوائل القياسي. قم بتوصيل الخزان بمجموعة المضخات.
ملاحظة: راجع وثائق الشركة المصنعة للروبوت للحصول على تفاصيل حول كيفية إجراء المعايرة لأنها ستعتمد على الروبوت. طابعات 3D القائمة على الراتنج هي الأنسب. ويرد مثال على نوع الطابعة المستخدمة في جدول المواد ؛ تم استخدام الراتنج الشفاف القياسي مع إعدادات الطابعة الافتراضية. - تجهيز النظام بمصرف متوافق مع توصيات السلامة الأحيائية المحلية.
- ضع أدوات المختبر على سطح روبوت مناولة السوائل كما هو موضح في الشكل 4.
- اتبع إجراءات السلامة القياسية ، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية القياسية للمختبر (مثل معطف المختبر والقفازات وحماية العين).
2. إعداد البرامج
- قم بتثبيت برنامج مفتوح المصدر يستخدم للتحكم في روبوتات معالجة السوائل باستخدام python11 ، المتاح من مستودع PyHamilton مفتوح المصدر. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- قم بتعديل ومعايرة ملف تخطيط سطح السفينة لبرنامج روبوت مناولة السوائل ليعكس بدقة مواضع الأدوات المعملية على سطح الروبوت ، كما هو موضح في الشكل 4.
ملاحظة: يستخدم الإعداد المستخدم هنا البرنامج الذي توفره الشركة المصنعة لروبوت معالجة السوائل ، وفقا للوثائق المقدمة. - قم بتشغيل برنامج طريقة الروبوت PRANCE في وضع المحاكاة.
- افتح سطر الأوامر بالأوامر التالية (في نظام التشغيل Windows) ، كما هو موضح في الشكل 5.
مفتاح ويندوز + R
أدخل: كمد - قم بتغيير الدليل الأصل إلى دليل برنامج أسلوب الروبوت. أدخل أمرا على النحو التالي بالمسار الصحيح ، كما هو موضح في الشكل 5.
مؤتمر نزع السلاح ج : \ Robot_methods_directory \\ PRANCE - اتصل ببرنامج طريقة الروبوت باستخدام Python بعلامة وضع المحاكاة ، كما هو موضح في الشكل 5.
py robot_method.py - محاكاة - حدد زر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة Robot Run Control التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج (الشكل 5).
ملاحظة: تأكد من إمكانية تشغيل طريقة PRANCE بدون أخطاء في المحاكاة قبل المضي قدما. يصبح من الواضح ما إذا كان البرنامج النصي قادرا على العمل في وضع المحاكاة دون أخطاء ، حيث سيكمل حلقات متعددة من البرنامج الرئيسي دون استدعاء معالجة أخطاء النظام ، مما يؤدي إلى إنهاء حلقة البرنامج الرئيسية.
- افتح سطر الأوامر بالأوامر التالية (في نظام التشغيل Windows) ، كما هو موضح في الشكل 5.
- قم بتشغيل برنامج طريقة الروبوت PRANCE مع تعطيل وضع المحاكاة.
- افتح سطر الأوامر في الدليل المناسب (الشكل 5).
مفتاح ويندوز + R
أدخل: كمد
مؤتمر نزع السلاح ج : \ Robot_methods_directory \\ PRANCE - اتصل ببرنامج طريقة الروبوت باستخدام Python بدون أعلام:
py robot_method.py - حدد زر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة التحكم في تشغيل الروبوت التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج.
- تأكد من أن PyHamilton يمكنه التحكم في الأداة والتسبب في تهيئتها.
- افتح سطر الأوامر في الدليل المناسب (الشكل 5).
- إنشاء مزامنة البيانات في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: حتى الآن ، استخدمت أنظمة PRANCE أجهزة كمبيوتر متصلة بالشبكة تسمح للمستخدمين بمراقبة ملفات السجل والرسوم البيانية لقياس قارئ اللوحات في الوقت الفعلي عبر برنامج مشاركة الملفات عن بعد ، أو عبر سطح مكتب بعيد. - قم بإيقاف تشغيل التحديثات التلقائية.
3. إعداد ما قبل التشغيل
- تأكد من أن مصادر الاستزراع البكتيري في المرحلة اللوغاريتمية متاحة لجميع المزارع المطلوبة للتشغيل المخطط له وأنه يتم تحريكها بنشاط لمنع الترسيب. استخدم كيموستات / توربيدوسات نشط أو مزرعة مبردة سابقة النمو متوقفة عن النمو.
- قم بتحديث ملف بيان وحدة التحكم بتفاصيل الحجم (النطاق 0-500 ميكرولتر) الذي سيتم ضخه في كل بئر من البحيرة المكونة من 96 بئرا لكل دورة برنامج. هذا يسمح بالتحكم الدقيق في معدل تخفيف البحيرة الفعال. يمكن ملاحظة ذلك في الشكل 6.
- احسب معدل التخفيف للبحيرة باستخدام جدول بيانات DilutionCalculator.xlsx (المقدم كملف تكميلي 2) ، كما هو موضح في الشكل 7.
- قم بتحديث ملف robot_method.py بارتفاع البحيرة المقصود. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم 14 (بوحدات المليمتر ) كقيمة افتراضية للمتغير fixed_lagoon_height في البرنامج. يتوافق هذا مع حجم بحيرة يبلغ 550 ميكرولتر على النظام ولكنه قد يختلف اعتمادا على لوحة 96 بئرا عميقة مستخدمة.
- ضع أطراف ماصة نظيفة مفلترة على سطح الروبوت في مواضعها المحددة وقم بلصق رفوف الأطراف على حوامل الأطراف لضمان الثبات أثناء الجري.
- ضع لوحات نظيفة من 96 بئرا عميقا على سطح الروبوت في مواقعها المخصصة.
- ضع لوحات قارئ نظيفة من 96 بئرا على سطح الروبوت في مواضعها المخصصة.
- تأكد من أن درج قارئ اللوحة غير مشغول بلوحة موجودة مسبقا.
- تأكد من توصيل المضخات بالكمبيوتر وتعيينها إلى العنوان الصحيح.
- نظف خطوط الضخ عن طريق تنشيط المضخات لضخ المبيض ثم الماء.
- قم بتوصيل خطوط الضخ بالمصادر والمخرجات المناسبة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لضمان توصيل الخطوط الصحيحة بالمزارع البكتيرية ذات الصلة.
- إعادة تعبئة الخزانات / الدلاء التي تحتوي على مبيض / ماء لغسل الخزان البكتيري وطرف الماصة.
- تأكد من استقرار جميع المكونات الموجودة على سطح السفينة ، وخاصة العناصر المتحركة ، في مواقعها المحددة.
- تنشيط السخانات حسب التنفيذ المحلي لدرجة الحرارة المستهدفة (أي 37 درجة مئوية ؛ الشكل 8).
- قم بتشغيل ملف بروتوكول التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق لتشغيل مصباح التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية المدمج في روبوتات مناولة السوائل كما توفرها الشركة المصنعة (الشكل 9).
- حدد زر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة التحكم في تشغيل الروبوت التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج.
- قم بتشغيل الملف باستخدام الخيار ذي المعلمات لمدة 600 ثانية.
- تأكد من إغلاق برنامج التحكم في تشغيل الروبوت.
ملاحظة: سيتعطل برنامج أسلوب الروبوت في حالة وجود أية مثيلات موجودة من تشغيل برنامج "التحكم في التشغيل".
4. تكامل الأجهزة والبرامج
- قم بإجراء "تشغيل مائي" ، حيث يتم تشغيل برنامج طريقة الروبوت PRANCE بين عشية وضحاها مع استبدال المياه لجميع الثقافات والكواشف الرطبة.
ملاحظة: يمكن إجراء هذا الاختبار في درجة حرارة الغرفة.- أكمل التحضير المسبق كما هو مفصل أعلاه مع إعداد controller_manifest و robot_method لمعدل تخفيف فعال للبحيرة يبلغ 1 حجم / ساعة كما هو موضح في الشكل 5 والشكل 6.
- قم بتوصيل خط "البكتيريا في" بوعاء من الماء ليحل محل بكتيريا الطور اللوغاريتمي لجريان المياه.
ملاحظة: يمكن إضافة تلوين الطعام إلى مصادر المياه لتتبع حركة السائل خلال التجربة. - افتح سطر الأوامر في الدليل المناسب.
- اتصل ببرنامج طريقة الروبوت باستخدام Python بعلامة التشغيل الجديدة (py robot_method.py --new) وأدخل الوسيطات المطلوبة ، بما في ذلك اسم ملف السجل (TestRun) ، وعدد آبار البحيرة (16) ، ومدة الدورة (30) ، وعدد الدورات لكل قياس لوحة قارئ (4) ، وحجم المحفز (حجم المحفز هو 0 ميكرولتر لهذا الاختبار ، أثناء التطور حيث يتم تحفيز الطفرات مع أرابينوز ، قد تكون هذه القيمة 10 ميكرولتر) ، كما هو موضح في الشكل 5.
- حدد الزر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة Robot Run Control التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج بمجرد توفير الوسيطات.
ملاحظة: يمكن بدء طريقة PRANCE باستخدام صفيحة بحيرة فارغة ، وسوف يتوازن حجم السائل في البحيرات مع الحجم النهائي خلال الدورات الست الأولى.
- قم بإجراء "تشغيل البكتيريا فقط" ، حيث يتم تشغيل بروتوكول PRANCE بين عشية وضحاها فقط مع الثقافة البكتيرية في درجة الحرارة المستهدفة ولكن بدون بكتيريا.
- أكمل التحضير المسبق كما هو مفصل أعلاه مع إعداد controller_manifest و robot_method لمعدل تخفيف فعال للبحيرة يبلغ 1 حجم / ساعة ، كما هو موضح في الشكل 5 والشكل 6. تأكد من تشغيل السخانات لدرجة حرارة مستهدفة تبلغ 37 درجة مئوية.
- قم بتوصيل خط "البكتيريا في" بالمصدر المحدد للبكتيريا اللوغاريتمية.
- افتح سطر الأوامر في الدليل المناسب.
- اتصل ببرنامج طريقة الروبوت باستخدام Python باستخدام علامة التشغيل الجديدة (py robot_method.py --new) وأدخل الوسيطات المطلوبة ، كما هو مفصل سابقا في القسم 4.1.4.
- حدد الزر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة Robot Run Control التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج بمجرد توفير الوسيطات.
- قم بإجراء "اختبار العدوى" ، حيث يتم تحدي العاثيات التي تحمل بروتينا متطورا للانتشار على البكتيريا التي تتطلب هذا البروتين.
ملاحظة: حدد مسبقا البحيرات التي سيتم تلقيحها بالعاثيات والبحيرات التي لن يتم تلقيحها وبالتالي تعمل كبحيرات خالية من العاثيات للكشف عن التلوث المتبادل.- أكمل التحضير المسبق كما هو مفصل أعلاه مع إعداد controller_manifest و robot_method لمعدل تخفيف فعال يبلغ 1 حجم / ساعة ، كما هو موضح في الشكل 5 والشكل 6. تأكد من تشغيل السخانات لدرجة حرارة مستهدفة تبلغ 37 درجة مئوية.
- قم بتوصيل خط "البكتيريا في" بالمصدر المحدد للبكتيريا اللوغاريتمية.
- افتح سطر الأوامر في الدليل المناسب.
- اتصل ببرنامج طريقة الروبوت باستخدام Python بعلامة التشغيل الجديدة (py robot_method.py --new) وأدخل الوسيطات المطلوبة كما هو مفصل سابقا في القسم 4.1.4.
- حدد الزر PLAY في الجزء العلوي الأيسر من نافذة Robot Run Control التي ستفتح عند تنفيذ البرنامج بمجرد توفير الوسيطات.
- قبل إضافة البكتيريا ، قم بتشغيل الطريقة لمدة 2-3 ساعات لموازنة الحجم والبكتيريا OD في ألواح البحيرة.
- قم بتلقيح البحيرات التي تحتوي على العاثيات ب 106 pfu / mL من البكتيريا في نهاية دورة التشغيل عندما يكون البرنامج نائما (على سبيل المثال ، 5.5 ميكرولتر من قسمة العاثية عند 108 pfu / mL ، كما هو محدد بواسطة مقايسة البلاك أو qPCR) ، في بحيرة 550 ميكرولتر.
- قم بتشغيل البرنامج طوال الليل ثم تحقق من عيار العاثيات في آبار البحيرة عن طريق فحص البلاك أو qPCR.
Representative Results
نتائج اختبار العدوى
سيكشف هذا الاختبار عن مشاكل في الثقافة البكتيرية ، واستنساخ العاثيات والعيار ، واستقرار درجة حرارة المعدات ، وإعدادات معالجة السوائل ، وتكامل قارئ اللوحة. سيكشف اختبار عدوى العاثية الناجح عن إصابة واضحة وسريعة بالعاثيات في البحيرات الملقحة بالعاثيات ، ولا توجد إشارة في البحيرات الخالية من العاثيات. يوضح الشكل 10 بعض النتائج التمثيلية لاختبار عدوى العاثيات. يمكن أيضا مقارنة النتائج التجريبية بالشكلين 1d و 1c من ورقة PRANCE8 هذه ، اعتمادا على ما إذا كان يتم تنفيذ تكوين "PRANCE الساخن" (الذي يغذيه توربيدوستات بكتيري حي) أو "PRANCE البارد" (الذي تغذيه ثقافة مرحلة منتصف السجل المبردة). قد يكشف هذا الاختبار عن العديد من المشكلات الشائعة. غالبا ما تؤدي المشكلات المتعلقة بإعداد الثقافة البكتيرية إلى ضعف العدوى أو غيابها. لا يمكن أن تصاب البكتيريا على النحو الأمثل إلا ب M13 phage عندما تكون في مرحلة منتصف السجل وعند 37 درجة مئوية. في درجات الحرارة ومراحل النمو الأخرى ، تظهر تعبيرا أضعف وبالتالي تكون أقل عرضة للإصابة بالعاثيات12. يمكن أن يؤدي التلقيح باستخدام عاثية منخفضة العيار ، أو عاثيات مع طفرات العمود الفقري إلى تأخر الإشارة أو غيابها. سيتم الكشف عن المشكلات المتعلقة بإعدادات كسب قارئ اللوحة للتألق أو التلألؤ من خلال هذا الاختبار.
الشكل 1: رسم تخطيطي للدائرة الوراثية التي تعمل أثناء تشغيل اختبار العدوى لجهاز PRANCE. عندما يصيب بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، المشفر على جينوم العاثية ، مضيف الإشريكية القولونية ، يتم نسخه وربطه على AP في مروج T7 ، مما يؤدي إلى نسخ بروتين pIII phage وبروتين luxAB ، والذي بدوره يسهل انتشار العاثية وإنتاج التلألؤ. الاختصارات: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات ؛ AP = بلازميد ملحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي للمكونات الفيزيائية لنظام PRANCE. تخزن الثلاجة الثقافات المثارة ، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى سطح الروبوت بواسطة مجموعة من المضخات ، إلى الخزان البكتيري ، "الوافل". يستخدم روبوت مناولة السوائل لنقل المزارع البكتيرية من "الوافل" باستخدام رأس السحب إلى الآبار القابضة للتدفئة إلى درجة حرارة الحضانة ، ثم إلى البحيرات حيث تحدث الحضانة الرئيسية. كل من الآبار القابضة والبحيرات هي ألواح آبار عميقة قياسية سعة 2 مل. يأخذ الروبوت العينات إلى لوحات القارئ ذات الاستخدام الواحد ، والتي يتم نقلها بدورها إلى قارئ الألواح للقياس. اختصار: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الجهاز الروبوتي PRANCE. (أ) إعداد PRANCE. (I) فلتر HEPA وسخان خارجي. (II) ثلاجة الثقافة. (III) حاوية الروبوت الرئيسية. (IV) قارئ اللوحة. (V) المضخات والخزانات. (ب) حاوية الروبوت. (VI) مضخات الاستزراع الرئيسية. (سابعا ) خزانات المياه والنفايات والمبيض. (VIII) مضخات الغسالة. (ج) حاوية الروبوت. (IX) ذراع سحب الروبوت والقابض. (X) أطراف الماصة. (XI) مكون 3D مطبوع للسماح بتوزيع الثقافة على الروبوت ("الهراء"). (XII) لوحات لأخذ العينات في قارئ اللوحة. (XIII) دلاء لغسل الأطراف. (XIV) "البحيرات": أوعية الاستزراع التي تحدث فيها الزراعة التطورية. الاختصارات: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات ؛ HEPA = هواء جسيمات عالي الكفاءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تخطيط سطح السفينة. (أ) تمثيل 3D لتخطيط سطح السفينة في برنامج التحكم في الروبوت. (ب) صورة فوتوغرافية لمكونات سطح السفينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: لقطة شاشة لسطر الأوامر مع مثال على المعلمات (أعلاه) وتشغيل برنامج التحكم (أدناه). يوجد زر التشغيل في أعلى اليسار ويمكن النقر عليه بالماوس أو تشغيله بشاشة تعمل باللمس اعتمادا على التنفيذ المحلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: ملف بيان وحدة التحكم كما تم تكوينه لعمليات الاختبار. ستكون البحيرات التي تحتوي على ثقافة # 0 في العمودين 1 و 3 من لوحة البئر العميقة 96. ستكون الأعمدة المتبقية فارغة. يتم تمييز الصفوف A و B و D و E من لوحة البئر العميقة 96 على العمود الأيمن للعدوى بالعاثية (1) ، والصفوف الأخرى (0) عبارة عن عناصر تحكم بدون عاثيات. سيؤدي هذا المثال من بيان وحدة التحكم إلى قيام البرنامج بتخفيف البحيرة ب 210 ميكرولتر من الاستزراع كل دورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: حساب معدل التخفيف الفعال للبحيرة باستخدام جدول بيانات DilutionCalculator. راجع الملف التكميلي 2 لجدول بيانات DilutionCalculator. كما هو موضح في هذا الشكل ، فإن بحيرة 550 ميكرولتر مخففة بمقدار 210 ميكرولتر من المستنبتة الطازجة كل دورة مدتها 30 دقيقة ، مع عينات 150 ميكرولتر لقياس لوحة القارئ التي يتم أخذها كل أربع دورات ستتوافق مع معدل تخفيف فعال يبلغ 1.0 حجم البحيرة / ساعة (بعد كل ساعة واحدة ، سيبقى 50٪ من سائل البحيرة الأصلي في بداية الساعة) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا شكل.
الشكل 8: نظام سخان الروبوت. يتم تنشيط السخان عن طريق توصيل مصدر الطاقة كما هو موضح بالدائرة الحمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: إعدادات بروتوكول إزالة التلوث بالأشعة فوق البنفسجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: قياس اختبار العدوى الذي يتم إجراؤه على نظام PRANCE. يتم أخذ العينات أثناء الجري ويتم إجراء قياسات التلألؤ والامتصاص. لكل بحيرة ، يتم تقسيم قياسات التلألؤ حسب قياس الامتصاص المقابل ويتم رسمها كدالة للوقت. البحيرات المصابة بالعاثيات ملونة باللون الأخضر ، في حين أن بحيرات التحكم غير المصابة ملونة باللون الأسود. اختصار: PRANCE = التطور شبه المستمر بمساعدة العاثيات والروبوتات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: ملف STL للطباعة ثلاثية الأبعاد لمكونات السطح المخصصة المطلوبة لنظام PRANCE ، بما في ذلك ، على الأقل ، مشعب الخزان / التوزيع البكتيري ("الهراء"). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: جدول بيانات حاسبة التخفيف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
على الرغم من الجهود المبذولة لتوحيد المعدات ، من الناحية العملية ، سيكون كل إعداد PRANCE مختلفا بسبب التغييرات في توريد المعدات والأجهزة وإصدار البرامج. نتيجة لذلك ، يظهر كل إعداد PRANCE تحديات إعداد فريدة ، مما يتطلب فهما شاملا للغرض من كل مكون لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها المعيارية الفعالة.
تحدد هذه الطريقة بروتوكولا خطوة بخطوة لإعداد واختبار نظام PRANCE المعمول به. نركز أولا على العناصر الحاسمة للأجهزة والبرامج ثم نفصل الخطوات الأساسية للتحضير وإجراء سلسلة من عمليات الاختبار ، والتي تثبت أن النظام جاهز ل PRANCE.
تتمثل إحدى الميزات الأساسية للأجهزة في التحسين لتقليل مخاطر التلوث المتبادل للعينة أثناء التجارب المتعددة باستخدام البكتيريا. يوصى باستخدام أطراف تمت تصفيتها حصريا مع تقنية طرف الروبوت المتوافقة مع إعادة استخدام الطرف ويعتقد أنها تقلل من الهباء الجوي الناتج أثناء طرد الطرف عن طريق تجنب الأطراف المناسبة. يسمح غسل الأطراف القوي وفقا لهذا البروتوكول بإعادة استخدام الطرف على الرغم من أنه يجب التحقق من كفاية ذلك كجزء من اختبار العدوى على كل نظام. يعتمد التعقيم الذاتي أيضا على إمدادات ثابتة من الماء والتبييض للنظام. يتم تخزينها في خزانات / دلاء وإذا استنفدت ستؤدي إلى ضعف التعقيم الذاتي والتلوث المتبادل السريع. يمكن التقاط صور للخزانات / الدلاء التي تم التقاطها قبل وبعد تشغيل البرنامج لقياس معدل استهلاك معدات الغسيل للمياه والمبيض بالنظر إلى إعداد مضخة معين.
عنصر رئيسي آخر في النظام هو الحفاظ على مرحلة نمو البكتيريا ودرجة الحرارة. يتم إجراء تجارب PRANCE باستخدام سلالة بكتيريا S2060 E. coli (Addgene: # 105064). هذه سلالة تحتوي على بلازميد F مشتقة من K12 محسنة لتقليل الأغشية الحيوية7. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحرير F-plasmid في هذه السلالة بإضافة كاسيت مقاوم للتتراسيكلين لصيانة البلازميد ، luxCDE و luxR لاستكمال مراقبة التلألؤ بوساطة luxAB ، بالإضافة إلى lacZ تحت محفز صدمة العاثية للسماح بالتصور اللوني للويحات. يعد F-pilus المشفر بالبلازميد F ضروريا لعدوى العاثية M13. لذلك يجب استزراع البكتيريا المستخدمة في PACE عند 37 درجة مئوية وفي مرحلة منتصف السجل عندما يتم التعبير عن F-pilus12 وتكون عدوى العاثية M13 وانتشارها وتطورها ممكنة. لتنظيم درجة الحرارة الساكنة ، يمكن استخدام حامل لوحة ساخنة جاهزة. البديل هو ببساطة تسخين الهواء الداخل إلى مرشح HEPA باستخدام سخانات غير مكلفة ، على الرغم من أن هذا غير مستحسن لأنه قد يؤدي إلى تسارع التآكل والتلف على الأجهزة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي ذلك إلى تسريع تبخر السوائل المساعدة على سطح السفينة ، مثل دلاء التبييض / الماء والمحفز ، عند استخدامها.
تعد معايرة حزم البرامج ضرورية أيضا لوظيفة النظام المناسبة. الاختلافات بين تخطيط سطح البرنامج ومجموعة الروبوت الفعلية هي السبب الأكثر شيوعا لفشل النظام أثناء التشغيل. تعد المعايرة المنتظمة للمضخات المساعدة التي تزود الثقافة البكتيرية والتبييض واستنزاف النظام أمرا حيويا لأن استخدام المضخة التمعجية يمكن أن يؤدي إلى تآكل الأنابيب وتغيرات حجم السوائل.
سيكشف اختبار تشغيل المياه بسرعة عن عدد من مشكلات الإعداد الشائعة ، بما في ذلك إعدادات معالجة السوائل غير الصحيحة ، وتسريبات السوائل / التوصيلات الخاطئة ، وعدم استقرار البرامج. لن يظهر تشغيل المياه الناجح أي تسرب سائل غير متوقع ويعمل بثبات دون أخطاء بين عشية وضحاها. هناك عدد من المشكلات الشائعة التي قد تنشأ أثناء تشغيل المياه مثل الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، والتقطير من الماصات ، وتوقف البروتوكول في منتصف التشغيل. في حالة الفشل في تنفيذ بعض خطوات معالجة السوائل ، تأكد من تركيب جميع فئات السوائل. تسرد هذه اللزوجة وسرعات السحب المناسبة ويتم ضبطها في برنامج التحكم في الروبوت الذي توفره الشركة المصنعة. إذا كان هناك تقطير من الماصات ، فمن المهم أن تكون إعدادات ذراع سحب الروبوت صحيحة لتمكين السحب النظيف والقضاء على التلوث المتبادل للعاثيات. يتطلب السحب الروبوتي الناجح ، بالإضافة إلى فئات السوائل الصحيحة ، ارتفاعات تخطيط سطح السفينة الصحيحة لجميع أدوات المختبر ، وإزاحات ارتفاع السحب المناسبة المحددة في برنامج طريقة الروبوت PRANCE. قد تتطلب إزاحات الارتفاع هذه ضبطا مباشرا. إذا توقف البروتوكول في منتصف التشغيل ، فغالبا ما يتم إنشاء ذلك بواسطة مجموعة واسعة من الأخطاء التي تشير إلى أن ملف تخطيط سطح السفينة قد لا يتطابق مع تكوين سطح السفينة الفعلي.
سيكشف اختبار التشغيل البكتيري فقط عن مشكلات في إعدادات قارئ الألواح وتصور البيانات في الوقت الفعلي ، ومشاكل التركيز المفرط للتبييض أو الشطف غير الكافي ، واستقرار درجة الحرارة. سيظهر الجري الناجح للبكتيريا فقط توازنا في امتصاص البحيرة خلال الدورات الثلاث الأولى ، يليه امتصاص مستقر طوال مدة الجري. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكشف عن العديد من المشكلات الشائعة. هذه هي الخطوة الأولى حيث يتم رسم البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ اللوحة. قد لا يتم حفظ البيانات الموجودة في قاعدة بيانات قارئ اللوحات بشكل صحيح أو رسمها بشكل صحيح. إذا فشلت البكتيريا في التوازن في امتصاصها ، فقد يشير ذلك إلى أن تركيز التبييض مرتفع للغاية. يمكن أن يؤدي التبييض المفرط أو الغسيل غير الكافي إلى تعقيم التجربة بأكملها ، بدلا من مجرد قطعة من أدوات المختبر. في حالة الاشتباه في ذلك ، يمكن استخدام شرائط الكشف عن المبيض لاختبار البحيرة. يمكن التحقق من استقرار درجة حرارة الثقافة باستخدام مسدس ميزان الحرارة.
يشير اختبار العدوى الناجح إلى أن النظام جاهز لتشغيل PRANCE. يمكن إجراء اختبار العدوى عن طريق تلقيح مجموعة فرعية من البحيرات التي تحتوي على ثقافة بكتيرية. ستعبر هذه البكتيريا عن pIII عند الإصابة بالعاثية المناسبة التي تفتقر إلى جين pIII (ΔgIII) ، مما يسمح بانتشار العاثيات. أحد التوليفات الممكنة للاختبار هو استخدام بكتيريا S2060 المحولة باستخدام بلازميد يعبر عن pIII تحت محفز صدمة العاثية مع أي عاثية ΔgIII. نوصي باستخدام العاثية ΔgIII التي تحمل بوليميراز T7 RNA من النوع البري مع بكتيريا S2060 المحولة ببلازميد ملحق ، حيث يتم تشغيل pIII و luxAB بواسطة مروج T7 (Plasmid pJC173b13) ، كما هو موضح في الشكل 1. يسمح هذا أيضا بمراقبة العدوى بوساطة قارئ اللوحة أثناء تشغيل الاختبار. سيأتي الدليل القاطع على نجاح اختبار العدوى وعدم وجود تلوث متبادل من معايرة العاثيات لبحيرات الاختبار والتحكم. عند استخدام مراسل لوسيفيراز ، فإن زيادة التلألؤ في آبار الاختبار فقط ، كما هو موضح في الشكل 3 ، هي أيضا مؤشر على نجاح عدوى العاثيات وانتشارها. المعيار الذهبي لقياس عيار العاثيات هو مقايسةالبلاك 7. هناك أيضا بروتوكول للقياس الكمي M13 بواسطة qPCR7 قد يكون أسرع ، على الرغم من أن هذا لا يميز بين جزيئات العاثيات المعدية وغير المعدية وبالتالي قد يبالغ في تقدير التتر.
يشير البرنامج الرئيسي إلى ملف بيان ، وهو ملف قاعدة بيانات نص عادي ، والذي يملي حجم التخفيف لكل دورة لكل مزرعة تكاثر بالإضافة إلى اختيار أي عدد من المواد الأولية المحتملة للثقافة البكتيرية ، والتي قد تختلف في صرامة الاختيار. بهذه الطريقة ، يحدد ملف البيان العديد من معلمات تشغيل PRANCE. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحرير هذا الملف أثناء التشغيل إما بواسطة المشغل أو النظام ، مما يعني أنه يمكن إجراء التحكم اليدوي أو التلقائي في التغذية المرتدة.
تكمن فائدة إعداد PRANCE الذي يعمل بكامل طاقته في قدرته على التطور السريع لعدد كبير من السكان في بيئة يتم مراقبتها والتحكم فيها بعناية. يميز التنسيق القائم على اللوحة PRANCE عن التقنيات الأخرى ، مثل استخدام أنظمة أصغر قائمة على التوربيداتالجاهزة 14,15. لا يسهل الإعداد القائم على اللوحة التكامل السهل مع خطوات المعالجة الروبوتية الإضافية فحسب ، بل يسهل أيضا التوافق مع الأدوات المختبرية الأخرى مثل أجهزة الطرد المركزي. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على إجراء التطور المتسارع بشكل متزامن عبر حالات متعددة تقدم بعدا إضافيا للتجربة ، مما يعزز احتمال تحقيق نتائج متنوعة وقوية. يعزز نظام التحكم والتغذية المرتدة الحبيبي المتكامل في PRANCE إمكانية التنبؤ وموثوقية التجربة ، مما يمثل تقدما كبيرا في مجال تقنيات التطور الموجه. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية محدودة في عدد التجارب الموازية التي يمكن أن تجريها. اعتمادا على التكوين ، عادة ما تكون إعدادات PRANCE محدودة إما بسرعة سحب الروبوت أو من خلال مساحة سطح السفينة المتاحة.
يمكن أيضا تطبيق نفس الأجهزة والبرامج المستخدمة في PRANCE على طرق التطور التي لا تتضمن البكتيريا. كما هو موضح في طريقة multi-turbidostats11 ، يمكن استخدام هذه الأداة نفسها حصريا مع البكتيريا ، مما يتيح تجارب التطور التكيفي للجينوم الكامل. هذه القدرة على التكيف توسع نطاق هذه الأداة ، مما يمهد الطريق لأشكال جديدة من التطور المتسارع بالروبوتات.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر إيما تشوري وكيفن إسفلت على مساعدتهما ونصائحهما في إعداد الأجهزة والبرامج. يتم دعم سمير أودجان وأوسعيد أثير وإريكا ديبينيديكتيس من قبل منحة الباحث المبكر في ستيل بيرلوت. تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (CC2239) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (CC2239) ، وصندوق ويلكوم (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
