Summary
Phage- og robotassisteret nærkontinuerlig evolution (PRANCE) er en teknik til hurtig, robust proteinudvikling. Robotik tillader parallelisering af eksperimenter, realtidsovervågning og feedbackkontrol.
Abstract
Robotaccelererede evolutionsteknikker forbedrer evolutionens pålidelighed og hastighed ved hjælp af feedbackkontrol, hvilket forbedrer resultaterne af protein- og organismeudviklingseksperimenter. I denne artikel præsenterer vi en guide til opsætning af den hardware og software, der er nødvendig for at implementere Phage- og Robotics-assisteret Near-continuous Evolution (PRANCE). PRANCE kombinerer hurtig fagbaseret molekylær evolution med evnen til at køre hundredvis af uafhængige, feedback-kontrollerede evolutionseksperimenter samtidigt. Dette papir beskriver hardwarekravene og opsætningen til PRANCE, herunder et væskehåndteringsinstrument, en pladelæser, hjælpepumper, varmeapparater og 3D-printede beholdere. Vi beskriver, hvordan man konfigurerer væskehåndteringsrobotten til at være kompatibel med Python-baseret open source-software. Endelig giver vi forslag til de to første eksperimenter, der kan udføres med et nykonstrueret PRANCE-system, der træner sine evner og validerer, at systemet er klar til at udføre multiplekset evolution. Denne vejledning er beregnet til at tjene som en håndbog til at navigere i det betydelige udstyrsopsætning, der er forbundet med at udføre robotik-accelereret evolution.
Introduction
PRANCE er en kombination af to kraftfulde styrede evolutionsteknikker. For det første er PACE1, en molekylær teknik, der kobler runder af gendiversificering og selektion til M13-bakteriofagens hurtige livscyklus, hvilket gør det muligt for hurtige udviklingsrunder at forekomme kontinuerligt i flydende fagkultur. Denne selektion er drevet af brugen af et plasmidkodet genkredsløb, der kobler funktionen af det udviklende protein til ekspressionen af pIII, M13's halepelsprotein, som er nødvendigt for fagformering, dette er illustreret i figur 1. På forsøgsniveau muliggør kontinuerlig fortynding af den flydende fagkultur kontinuerlig udvælgelse. Selektionsstrenghed kan således moduleres både på genkredsløbsniveau såvel som på forsøgsniveau ved at kontrollere fagkulturens fortyndingshastighed. PACE kan derfor anvendes til enhver biomolekyleteknisk udfordring, hvor der er en molekylær sensor, der kan detektere den ønskede aktivitet i E. coli-bakterier for at inducere pIII-ekspression. Anvendelser omfatter udviklingen af protein-proteinbinding 2,3,4, protein-DNA-binding5, proteinopløselighed6 og adskillige specifikke enzymatiske funktioner7. For det andet er Robotics-accelereret Evolution 8,9, som bruger en feedback-controller til at eliminere to almindelige fejltilstande for rettet evolution: udryddelse, der opstår, når miljøet er for strengt, og mangel på evolution, der opstår, når miljøet er for lempeligt. I modsætning til seriel passaging af som gjort i PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, involverer robotaccelereret "nær-kontinuerlig" evolution hurtig pipettering, der opretholder kulturer midt i logfasen, hvilket gør det muligt for populationer at opleve kontinuerlige cyklusser af infektion og formering. Når disse to teknologier bruges sammen, kaldes de PRANCE for Phage and Robotics-assisteret nær-kontinuerlig evolution8, som muliggør robust, multiplekset og hurtig kontinuerlig udvikling. PRANCE er blevet anvendt til at udvikle polymeraser, tRNA'er og amino-acyl-tRNA-syntetaser og til at foretage feedbackkontrol under disse udviklinger for at forbedre deres hastighed og pålidelighed8.
Der er flere detaljer om hardware- og softwareopsætningen til PRANCE, der muliggør brug af bakteriofag på en væskehåndteringsrobot. I stedet for at bruge standardsoftware leveret af robotproducenten bruger vi en python-baseret open source-softwarepakke11, som muliggør hurtig, samtidig udførelse og dermed muligheden for at holde de semikontinuerlige bioreaktorer i midtlogfasen. Forskerens hands-off tid kan forlænges til flere dage ved at lade flere komponenter på dækket rutinemæssigt selvsterilisere, og dette opnås med automatisk styring af pumper, der kan blege og skylle disse komponenter. Fagkrydskontaminering kan elimineres ved brug af en væskehåndteringsrobot, der ikke bruger tvangsspidser og omhyggelig justering af væskehåndteringsindstillinger.
Protocol
1. Hardware opsætning
BEMÆRK: Se figur 2 for en oversigt over hardwarekomponenterne i et PRANCE-system og figur 3 for fotos af disse komponenter, der er fysisk samlet.
- Anskaf den primære hardware til PRANCE-systemet, herunder et væskehåndteringsinstrument, en pladelæser og hjælpepumper.
BEMÆRK: Alle PRANCE-systemer til dato er blevet implementeret på mellemstore til store væskehåndteringsinstrumenter udstyret med en 8-kanals, individuelt adresserbar pipetteringsarm, en pipetteringsarm med et stempel på 96 tip, en robotgriber til bevægelige plader, en integreret vaskestation til tipsterilisering og en integreret pladelæser, der er i stand til at måle absorbans og luminescens. - Konfigurer opvarmningsstrategierne afhængigt af væskehåndteringsrobotens model og funktioner. Brug en opvarmet pladebærer eller varmemedieret robotklimakontrol.
- Etabler en tip-vaskestation for at give mulighed for genbrug af lossepladser.
BEMÆRK: Hidtil har PRANCE systemer brugt hyldevaskestationer, selv om denne komponent i princippet let kunne konstrueres af billige komponenter. - Etablere en kilde til bakteriekultur, der opretholdes i log-fasen, ved at etablere en realtidsbioreaktor, der kører ved 37 °C som en kemostat/turbidostat. Alternativt standses en logfasebakteriekultur på mindst 1 L volumen, der er forvokset ved 37 °C i logfase (OD600 mellem 0,25 og 0,45) ved 4 °C i et køleskab i nærheden. Sørg for, at kulturen, hvad enten den er kølet eller varm, omrøres regelmæssigt ved hjælp af en rysteplade eller omrøringsplade for at forhindre sedimentering.
- Konfigurer de foretrukne pumper til robotintegration med den nødvendige software og drivere. Implementere softwaren, så pumperne kan levere definerede mængder væske i størrelsesordenen 10-100 ml.
BEMÆRK: Se materialetabellen for pumper, der anvendes i denne implementering, og producentens websted for software, der bruges til at betjene disse pumper, og dokumentation om, hvordan du konfigurerer dem. Sådan software til pumperne, der anvendes i PRANCE-opsætningen, der er illustreret i dette manuskript, leveres open source i følgende GitHub-lager https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE kræver mindst en trepumpemanifold, der er i stand til at pumpe tre separate kanaler (levere bakterier til bakteriereservoir, levere blegemiddel til bakteriereservoir og dræne bakteriereservoir til affald) med hastigheden af hver kalibreret og kontrolleret uafhængigt. Tidligere har folk brugt akvariumpumper og hydroponics pumpearrays, selvom enhver python-kontrollerbar peristaltisk pumpe i princippet kan anvendes. Væsentlige funktioner omfatter muligheden for at bruge en robotgriber til at overføre plader ind eller ud af læseren, til at starte en pladelæsermåling og til at få adgang til målinger. - 3D-Udskriv de nødvendige brugerdefinerede dækkomponenter til PRANCE-systemet, herunder som minimum bakteriebeholderen/fordelingsmanifolden ("vaffel"), som findes i supplerende fil 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Fastgør disse containere på dækket, og kalibrer deres positioner ved hjælp af standard Liquid Handling Robot-software. Tilslut reservoiret til pumpearrayet.
BEMÆRK: Se robotproducentens dokumentation for at få oplysninger om, hvordan du udfører kalibreringen, da den vil være robotafhængig. Harpiksbaserede 3D-printere er mest hensigtsmæssige; et eksempel på den anvendte printertype er angivet i materialefortegnelsen; Standard klar harpiks blev brugt med standardprinterindstillingerne. - Udstyr systemet med et afløb, der er kompatibelt med de lokale biosikkerhedsanbefalinger.
- Placer labware på dækket af væskehåndteringsrobotten som eksemplificeret i figur 4.
- Følg standard sikkerhedsprocedurer, herunder brug af standard laboratorie personlige værnemidler (dvs. lab coat, handsker og øjenbeskyttelse).
2. Software forberedelse
- Installer open source-software, der bruges til styring af væskehåndteringsrobotter med python11, tilgængelig fra open source PyHamilton-depotet. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Rediger og kalibrer dæklayoutfilen til væskehåndteringsrobotsoftwaren, så den nøjagtigt afspejler labware-positionerne på robotdækket, som vist i figur 4.
BEMÆRK: Den opsætning, der bruges her, bruger den software, der leveres af producenten af væskehåndteringsrobotten, i henhold til den medfølgende dokumentation. - Kør PRANCE-robotmetodeprogrammet i simuleringstilstand.
- Åbn kommandolinjen med følgende kommandoer (i Windows-operativsystemet), som vist i figur 5.
Windows-tast + R
Indtast: cmd - Skift den overordnede mappe til mappen for robotmetodeprogrammet. Indtast en kommando som nedenfor med den korrekte sti, som vist i figur 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Kald robotmetodeprogrammet med Python med simuleringstilstandsflaget, som vist i figur 5.
py robot_method.py --simulere - Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres (figur 5).
BEMÆRK: Sørg for, at PRANCE-metoden kan køre uden fejl i simuleringen, før du går videre. Det bliver indlysende, hvis scriptet er i stand til at fungere i simuleringstilstand uden fejl, da det vil fuldføre flere sløjfer af hovedprogrammet uden at systemets fejlhåndtering kaldes, hvilket afslutter hovedprogramsløjfen.
- Åbn kommandolinjen med følgende kommandoer (i Windows-operativsystemet), som vist i figur 5.
- Kør PRANCE-robotmetodeprogrammet med simuleringstilstanden deaktiveret.
- Åbn kommandolinjen i den relevante mappe (figur 5).
Windows-tast + R
Indtast: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Kald robotmetodeprogrammet med Python uden flag:
py robot_method.py - Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres.
- Bekræft, at PyHamilton kan styre instrumentet og få det til at initialisere.
- Åbn kommandolinjen i den relevante mappe (figur 5).
- Opret datasynkronisering i realtid.
BEMÆRK: Hidtil har PRANCE-systemer brugt netværkscomputere, der giver brugerne mulighed for at overvåge logfilerne og realtidsgraferne for pladelæsermåling via fjernfildelingssoftware eller via et fjernskrivebord. - Deaktiver automatiske opdateringer.
3. Forberedelse før kørsel
- Sørg for, at logfasebakteriekulturkilder er tilgængelige for alle kulturer, der kræves til den planlagte kørsel, og at de omrøres aktivt for at forhindre sedimentering. Brug en aktiv kemostat/turbidostat eller en vækststoppet nedkølet forvokset kultur.
- Opdater controllermanifestfilen med detaljer om, hvilket volumen (område 0-500 μL) af hvilken bakteriekultur der skal pumpes ind i hver brønd i 96-brøndlagunen pr. Programcyklus. Dette muliggør præcis kontrol af den effektive lagunefortyndingshastighed. Dette kan ses i figur 6.
- Beregn lagunens fortyndingshastighed ved hjælp af regnearket DilutionCalculator.xlsx (medfølger som supplerende fil 2), som vist i figur 7.
- Opdater robot_method.py filen med den tilsigtede lagunehøjde. For at følge denne protokol skal du bruge 14 (i millimeterenheder ) som standardværdi for den variable fixed_lagoon_height i programmet. Dette svarer til en lagunevolumen på 550 μL på systemet, men kan variere afhængigt af den særlige 96-dybe brøndplade, der anvendes.
- Placer rene, filtrerede pipettespidser på robotdækket i deres angivne positioner, og tape tipstativerne fast til spidsholderne for at sikre stabilitet under kørslen.
- Placer rene plader med 96 dybe brønde på robotdækket i deres udpegede positioner.
- Placer rene 96-brønds læserplader på robotdækket i deres udpegede positioner.
- Sørg for, at pladelæserbakken ikke er optaget af en allerede eksisterende plade.
- Sørg for, at pumperne er tilsluttet computeren og er tildelt den korrekte adresse.
- Rengør pumpeledningerne ved at aktivere pumperne til at pumpe blegemiddel og derefter vand.
- Tilslut pumpeledninger til de relevante kilder og udgange, og vær meget opmærksom på at sikre, at de korrekte ledninger er forbundet med de relevante bakteriekulturer.
- Genopfyldningstanke/spande, der indeholder blegemiddel/vand til bakteriereservoir og vask af pipettespidser.
- Sørg for, at alle komponenter på dækket, især mobile elementer, er stabiliseret på deres udpegede positioner.
- Aktivér varmelegemer i henhold til lokal implementering til måltemperatur (dvs. 37 °C; Figur 8).
- Kør UV Sterilization Protocol-filen i 10 minutter for at betjene den indbyggede UV-steriliseringslampe i væskehåndteringsrobotterne som leveret af producenten (figur 9).
- Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres.
- Kør filen med den parametriserede indstilling i 600 s.
- Sørg for, at softwaren Robot Run Control er lukket.
BEMÆRK: Robotmetodeprogrammet går ned, hvis der kører eksisterende forekomster af Run Control-softwaren.
4. Integration af hardware og software
- Udfør et 'vandløb', hvor PRANCE-robotmetodeprogrammet køres natten over med vand, der erstatter alle kulturer og våde reagenser.
BEMÆRK: Denne test kan køres ved stuetemperatur.- For-afprøvningen som beskrevet ovenfor afsluttes med de controller_manifest og robot_method, der er opstillet for en effektiv lagunefortyndingshastighed på 1 volumen/time som vist i figur 5 og figur 6.
- Tilslut 'bakterie i' linjen til en beholder med vand for at erstatte logfasebakterier til vandløbet.
BEMÆRK: Madfarve kan tilsættes til vandkilderne for at spore væskebevægelse gennem eksperimentet. - Åbn kommandolinjen i den relevante mappe.
- Kald robotmetodeprogrammet med Python med det nye kørselsflag (py robot_method.py --new) og indtast de ønskede argumenter, herunder logfilnavn (TestRun), antal lagunebrønde (16), cyklusvarighed (30), antal cyklusser pr. læserplademåling (4) og inducervolumen (inducervolumen er 0 μL for denne testkørsel under en udvikling, hvor mutagenese induceres med arabinose, kan denne værdi være 10 μL) som vist i figur 5.
- Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres, når argumenterne er angivet.
BEMÆRK: PRANCE-metoden kan startes med en tom laguneplade, og lagunernes væskevolumen vil ekvilibrere til det endelige volumen i løbet af de første seks cyklusser.
- Udfør en 'bakterie-only-kørsel', hvor PRANCE-protokollen kun køres natten over med bakteriekultur ved måltemperatur, men uden bakteriofag.
- For-afprøvningen som beskrevet ovenfor afsluttes med de controller_manifest og robot_method, der er indstillet til en effektiv lagunefortyndingshastighed på 1 volumen/time, som vist i figur 5 og figur 6. Sørg for, at varmelegemet er tændt for en måltemperatur på 37 °C.
- Forbind linjen 'bakterier i' til den valgte kilde til logfasebakterier.
- Åbn kommandolinjen i den relevante mappe.
- Kald robotmetodeprogrammet med Python med det nye kørselsflag (py robot_method.py --new) og indtast de ønskede argumenter, som beskrevet tidligere i afsnit 4.1.4.
- Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres, når argumenterne er angivet.
- Kør en 'infektionstest', hvor fager, der bærer et udviklet protein, udfordres til at formere sig på bakterier, der kræver dette protein.
BEMÆRK: Beslut på forhånd, hvilke laguner der skal podes med, og hvilke laguner der ikke skal podes og dermed fungere som laguner uden fagkontrol til at opdage krydskontaminering.- For-afprøvning som beskrevet ovenfor fuldføres med de controller_manifest og robot_method, der er indstillet til en effektiv fortyndingshastighed på 1 volumen/time, som vist i figur 5 og figur 6. Sørg for, at varmelegemet er tændt for en måltemperatur på 37 °C.
- Forbind linjen 'bakterier i' til den valgte kilde til logfasebakterier.
- Åbn kommandolinjen i den relevante mappe.
- Kald robotmetodeprogrammet med Python med det nye kørselsflag (py robot_method.py --new) og indtast de ønskede argumenter som beskrevet tidligere i afsnit 4.1.4.
- Vælg PLAY-knappen øverst til venstre i vinduet Robot Run Control , der åbnes, når programmet udføres, når argumenterne er angivet.
- Før du tilføjer bakteriofag, skal du køre metoden i 2-3 timer for at afbalancere volumen og bakterier OD i lagunepladerne.
- Pod lagunerne med 106 pfu/ml bakteriofag ved afslutningen af en kørselscyklus, når programmet sover (f.eks. 5,5 μL alikvote ved 108 pfu/ml, bestemt ved plaqueanalyse eller qPCR), i en 550 μL lagune.
- Kør programmet natten over, og kontroller derefter fagtiteren i lagunebrøndene ved hjælp af plaqueanalyse eller qPCR.
Representative Results
Infektion test resultater
Denne test vil afsløre problemer med bakteriekultur, fagkloning og titer, udstyrets temperaturstabilitet, væskehåndteringsindstillinger og pladelæserintegration. En vellykket faginfektionstest vil afsløre klar og hurtig faginfektion i laguner podet med og intet signal i laguner uden. Figur 10 viser nogle repræsentative resultater af en faginfektionstest. Eksperimentelle resultater kan også sammenlignes med figur 1d og 1c i dette PRANCE-papir8, afhængigt af om en "varm PRANCE" (fodret med en levende bakteriel turbidostat) eller "kølig PRANCE" (fodret med afkølet mid-log fasekultur) er ved at blive implementeret. Denne test kan afsløre flere almindelige problemer. Problemer med bakteriel kulturforberedelse kan ofte resultere i svag eller fraværende infektion. Bakterier kan kun inficeres optimalt med M13-, når de er midt i log-fasen og ved 37 °C. Ved andre temperaturer og vækststadier udviser de svagere pilusekspression og er dermed mindre modtagelige for faginfektion12. Podning med lavtiterfag eller med rygradsmutationer kan resultere i forsinket eller fraværende signal. Problemer med indstillinger for pladelæserforstærkning for fluorescens eller luminescens vil blive afsløret ved denne test.
Figur 1: Skematisk oversigt over det genetiske kredsløb, der fungerer under infektionstestkørslen af PRANCE-apparatet. Når T7 RNA-polymerase, kodet på faggenomet, inficerer Escherichia coli-værten , transkriberes den og binder på AP ved T7-promotoren, hvilket fører til transkription af pIII-fagproteinet og luxAB-proteinet, hvilket igen letter fagudbredelse og produktion af luminescens. Forkortelser: PRANCE =- og robotteknologiassisteret nær-kontinuerlig evolution; AP = tilbehør plasmid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Et skema over PRANCE-systemets fysiske komponenter. Et køleskab opbevarer omrørte kulturer, som derefter flyttes ind på robotdækket af en række pumper til bakteriereservoiret, "vaflen". Væskehåndteringsrobotten bruges til at flytte bakteriekulturer fra "vaffelen" ved hjælp af pipetteringshovedet til holdebrøndene for at varme op til inkubationstemperatur og derefter til lagunerne, hvor hovedinkubationen finder sted. Både holdebrøndene og lagunerne er standard 2 ml dybbrøndplader. Robotten tager prøver ind i engangslæserplader, som igen flyttes til en pladelæser til måling. Forkortelse: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: PRANCE-robotapparatet. (A) PRANCE-opsætning. I) HEPA-filter og eksternt varmelegeme. II) Dyrkning af køleskab. III) Hovedrobotkabinettet. (IV) Pladelæser. (V) Pumper og tanke. B) Robotindkapsling. VI) Hovedkulturpumper. (VII) Vand-, affalds- og blegemiddeltanke. VIII) Skivepumper. C) Robotindkapsling. IX) Robotpipetteringsarm og griber. (X) Pipettespidser. (XI) 3D-printet komponent, der muliggør kulturfordeling på robotten ("vaffel"). XII) Plader til prøveudtagning i pladelæseren. (XIII) Spande til tipvask. XIV) "laguner": kulturfartøjer, hvor evolutionær dyrkning finder sted. Forkortelser: PRANCE =- og robotteknologiassisteret nær-kontinuerlig evolution; HEPA = højeffektiv partikelluft. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dæklayout. (A) 3D-repræsentation af dæklayoutet i robotstyringssoftwaren. B) Fotografi af dækkets dele. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skærmbillede af kommandolinjen med eksempelparametre (ovenfor) og kør kontrolsoftware (nedenfor). Afspilningsknappen er placeret øverst til venstre og kan klikkes med en mus eller aktiveres med en berøringsskærm afhængigt af lokal implementering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Controllermanifestfilen som konfigureret til testkørsler. Laguner indeholdende kultur #0 ville være i kolonne 1 og 3 på den 96-dybe brøndplade. De resterende kolonner ville være tomme. Række A, B, D og E i den 96-dybe brøndplade er markeret i højre kolonne for infektion med (1), de andre rækker (0) er ikke-fagkontroller. Denne forekomst af controllermanifestet ville resultere i, at programmet fortynder lagunen med 210 μL kultur hver cyklus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Beregning af den effektive lagunefortyndingshastighed ved hjælp af regnearket DilutionCalculator. Se supplerende fil 2 for regnearket DilutionCalculator. Som det ses i denne figur, vil en 550 μL lagune, der fortyndes med 210 μL frisk kultur hver 30 minutters cyklus, med 150 μL prøver til aflæsningsplademåling, der tages hver fjerde cyklus, svare til en effektiv fortyndingshastighed på 1,0 lagunevolumener / h (efter hver 1 time forbliver 50% af den oprindelige lagunevæske ved timens begyndelse) Klik her for at se en større version af dette figur.
Figur 8: Robotvarmesystem. Varmelegemet aktiveres ved at tilslutte strømforsyningen som angivet med den røde cirkel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Indstillinger for UV-dekontamineringsprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: En måling af en infektionstest udført på PRANCE-systemet. Der udtages prøver under kørslen, og der foretages målinger af luminescens og absorbans. For hver lagune divideres luminescensmålingerne med den tilsvarende absorbansmåling og plottes som funktion af tiden. De laguner, der er blevet inficeret med, er farvet i grønt, mens de uinficerede kontrollaguner er farvet i sort. Forkortelse: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: STL-fil til 3D-udskrivning af de nødvendige brugerdefinerede dækkomponenter til PRANCE-systemet, herunder som minimum bakteriereservoiret/fordelingsmanifolden ("vaffel"). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: FortyndingLommeregner regneark. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
På trods af bestræbelser på at standardisere udstyr vil praktisk talt hver PRANCE-opsætning være forskellig på grund af ændringer i udstyrsforsyning, hardware og softwareversionering. Som følge heraf manifesterer hvert PRANCE-setup unikke opsætningsudfordringer, der kræver en omfattende forståelse af formålet med hver komponent til effektiv modulær fejlfinding.
Denne metode afgrænser en trinvis protokol til opsætning og test af et etableret PRANCE-system. Vi fokuserer først på de kritiske elementer i hardware og software og beskriver derefter de væsentlige trin for at forberede og gennemføre en række testkørsler, som fastslår, at systemet er klar til PRANCE.
Et væsentligt træk ved hardwaren er optimering for at reducere risikoen for krydskontaminering af prøver under multipleksede eksperimenter ved hjælp af bakteriofag. Det anbefales udelukkende at bruge filtrerede spidser med robotspidsteknologi, der er kompatibel med genbrug af spidser og menes at minimere aerosoler, der produceres under spidsudkastning ved at undgå tvangspasningsspidser. Robust tipvask i henhold til denne protokol giver mulighed for genbrug af spidser, selvom tilstrækkeligheden af dette skal valideres som en del af infektionstesten på hvert system. Selvsterilisering er også afhængig af en ensartet forsyning af vand og blegemiddel til systemet. Disse opbevares i tanke / spande, og hvis de udtømmes, vil det resultere i nedsat selvsterilisering og hurtig krydskontaminering. Der kan tages billeder af tanke / spande taget før og efter programmet kører for at benchmarke den hastighed, hvormed vaskeudstyret bruger vand og blegemiddel givet en bestemt pumpeopsætning.
Et andet centralt element i systemet er vedligeholdelsen af bakteriens vækstfase og temperatur. PRANCE forsøg udføres med S2060 E. coli bakteriestammen (Addgene: #105064). Dette er en K12-afledt F-plasmidholdig stamme, der er optimeret til at reducere biofilm7. Derudover er F-plasmidet i denne stamme blevet redigeret med tilføjelsen af en tetracyklinmodstandskassette til plasmidvedligeholdelse, luxCDE og luxR for at supplere luxAB-medieret luminescensovervågning samt lacZ under fagstødpromotoren for at muliggøre kolorimetrisk visualisering af plaques. Den F-plasmidkodede F-pilus er nødvendig for M13-faginfektion. Bakterier, der anvendes i PACE, skal derfor dyrkes ved 37 °C og midt i log-fasen, når F-pilus12 udtrykkes, og M13-faginfektion, formering og evolution er mulig. Til statisk temperaturregulering kan der anvendes en hyldeopvarmet pladebærer. Et alternativ er simpelthen opvarmning af luften, der går ind i HEPA-filteret ved hjælp af billige varmeapparater, selvom dette ikke anbefales, da det kan føre til accelereret slid på hardwaren. Derudover fremskynder dette fordampningen af hjælpevæsker på dækket, såsom blegemiddel/vandspande og inducer, når de anvendes.
Kalibrering af softwarepakkerne er også afgørende for korrekt systemfunktion. Afvigelser mellem softwaredækkets layout og det faktiske robotdæk er den mest almindelige årsag til systemfejl under drift. Regelmæssig kalibrering af hjælpepumperne, der forsyner bakteriekultur, bleges og dræner systemet, er afgørende, da peristaltisk pumpebrug kan føre til slid på slanger og ændringer i væskevolumen.
Vandløbstesten vil hurtigt afsløre en række almindelige opsætningsproblemer, herunder forkerte væskehåndteringsindstillinger, fluidiklækager / defekte forbindelser og softwarestabilitet. Et vellykket vandløb udviser ingen uventede væskelækager og kører stabilt uden fejl natten over. Der er en række almindelige problemer, der kan opstå under et vandløb, såsom manglende udførelse af visse væskehåndteringstrin, dryp fra pipetter og protokollen, der stopper midt i løbet. I tilfælde af manglende udførelse af visse væskehåndteringstrin skal du bekræfte, at alle væskeklasser er installeret. Disse angiver de passende viskositets- og pipetteringshastigheder og justeres i robotstyringssoftwaren, der leveres af producenten. Hvis der drypper fra pipetter, er det vigtigt, at robotpipetteringsarmens indstillinger er korrekte for at muliggøre ren pipettering og eliminere krydskontaminering af fager. Vellykket robotpipettering kræver, ud over korrekte væskeklasser, korrekte dæklayouthøjder for alt laboratorieudstyr og passende pipetteringshøjdeforskydninger, der er specificeret i PRANCE-robotmetodeprogrammet. Disse højdeforskydninger kan kræve direkte justering. Hvis protokollen stopper midt i serien, vil dette ofte blive genereret af en lang række fejl, der indikerer, at dæklayoutfilen muligvis ikke stemmer overens med den faktiske dækkonfiguration.
Testen, der kun kører bakterier, afslører problemer med pladelæserindstillinger og datavisualisering i realtid, problemer med overdreven blegemiddelkoncentration eller utilstrækkelig skylning og temperaturstabilitet. En vellykket bakterie-kun cyklus vil udvise ligevægt af laguneabsorbans i løbet af de første tre cyklusser, efterfulgt af stabil absorbans i løbet af løbet. Derudover kan det afsløre flere almindelige problemer. Dette er det første trin, hvor de data, der genereres af pladelæseren, plottes. Data i pladelæserdatabasen gemmes muligvis ikke korrekt eller plottes korrekt. Hvis bakterier ikke kan ekvilibrere i deres absorbans, kan det tyde på, at blegemiddelkoncentrationen er for høj. Overdreven blegemiddel eller utilstrækkelig vask kan sterilisere hele eksperimentet, snarere end blot stykket labware. Hvis der er mistanke om dette, kan blegemiddeldetekteringsstrimler bruges til at teste lagunen. Stabiliteten af kulturens temperatur kan kontrolleres med en termometerpistol.
En vellykket infektionstest indikerer, at systemet er klar til PRANCE-kørsler. En infektionstest kan udføres ved podning af en delmængde af laguner, der indeholder bakteriekultur. Disse bakterier vil udtrykke pIII, når de inficeres af den passende, der mangler genet for pIII (ΔgIII), hvilket tillader fagformering. En mulig kombination til test er at bruge S2060-bakterier transformeret med et plasmid, der udtrykker pIII under fagchokpromotoren med enhver ΔgIII-. Vi anbefaler at bruge ΔgIII-, der bærer vildtype T7 RNA-polymerase med S2060-bakterier transformeret med et tilbehørsplasmid, hvor pIII og luxAB drives af T7-promotoren (plasmid pJC173b13), som illustreret i figur 1. Dette muliggør også pladelæsermedieret overvågning af infektion under testkørslen. Endeligt bevis for infektionstestens succes og manglende krydskontaminering vil komme fra fagtitering af test- og kontrollaguner. Hvor der anvendes en luciferasereporter, er en stigning i luminescens kun i testhuller, som det ses i figur 3, også en indikator for vellykket faginfektion og -formering. Guldstandarden for fagtiterkvantificering er plaqueanalysen7. Der er også en protokol til M13-kvantificering ved qPCR7 , der kan være hurtigere, selvom dette ikke skelner mellem infektiøse og ikke-infektiøse fagpartikler og dermed kan overvurdere titere.
Hovedprogrammet refererer til en manifestfil, dette er en almindelig tekstdatabasefil, der dikterer fortyndingsvolumen pr. Cyklus for hver formeringskultur samt udvælgelsen af et vilkårligt antal potentielle bakteriekulturråmaterialer, som kan variere i udvælgelsesstrenghed. På denne måde definerer manifestfilen mange af parametrene for PRANCE-kørslen. Det skal bemærkes, at denne fil kan redigeres under kørslen af enten operatøren eller systemet, hvilket betyder, at manuel eller automatisk feedbackkontrol kan udføres.
Nytten af et fuldt fungerende PRANCE-setup ligger i dets evne til hurtigt at udvikle store populationer i et omhyggeligt overvåget og kontrolleret miljø. Det pladebaserede format adskiller PRANCE fra andre teknikker, som at bruge mindre turbidostatbaserede systemer14,15. Den pladebaserede opsætning letter ikke kun nem integration med yderligere robotbehandlingstrin, men også kompatibilitet med andre laboratorieinstrumenter såsom centrifuger. Desuden introducerer evnen til at gennemføre accelereret evolution samtidigt på tværs af flere forekomster en yderligere dimension til eksperimentet, hvilket øger udsigten til at opnå forskellige og robuste resultater. Det granulære kontrol- og feedbacksystem, der er integreret i PRANCE, styrker eksperimentets forudsigelighed og pålidelighed yderligere og markerer et betydeligt fremskridt inden for målrettede evolutionsteknikker. Denne teknik er imidlertid begrænset i antallet af parallelle eksperimenter, den kan udføre. Afhængigt af konfigurationen er PRANCE-opsætninger normalt begrænset enten af robotpipetteringshastighed eller af tilgængelig dækplads.
Den samme hardware og software, der anvendes til PRANCE, kan også anvendes på evolutionsmetoder, der ikke involverer bakteriofag. Som demonstreret i mange-turbidostater metode11, kan det samme instrument udelukkende anvendes med bakterier, hvilket muliggør helgenom-adaptive evolutionseksperimenter. Denne tilpasningsevne udvider anvendelsesområdet for dette instrument og baner vejen for nye former for robotteknologisk accelereret evolution.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Emma Chory og Kevin Esvelt for deres hjælp og råd med hardware- og softwareopsætning. Samir Aoudjane, Osaid Ather og Erika DeBenedictis støttes af Steel Perlot Early Investigator Grant. Dette arbejde blev støttet af Francis Crick Institute, som modtager sin kernefinansiering fra Cancer Research UK (CC2239), UK Medical Research Council (CC2239) og Wellcome Trust (CC2239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
