Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa
Summary
Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist dafür bekannt, dass er eine Vielzahl von Virulenzfaktoren produziert, um Infektionen im Wirt zu etablieren. Ein solcher Mechanismus ist das Abfangen von Eisen durch Siderophorproduktion. P. aeruginosa produziert zwei verschiedene Siderophore: Pyochelin, das eine geringere Eisenchelat-Affinität aufweist, und Pyoverdin, das eine höhere Eisenchelat-Affinität aufweist. Dieser Bericht zeigt, dass Pyoverdin direkt aus bakteriellen Überständen quantifiziert werden kann, während Pyochelin vor der Quantifizierung aus Überständen extrahiert werden muss.
Die primäre Methode zur qualitativen Analyse der Siderophorproduktion ist der Chrom-Azurolsulfonat-Agarplatten-Assay (CAS). In diesem Assay führt die Freisetzung des CAS-Farbstoffs aus demFe3+-Farbstoffkomplex zu einem Farbwechsel von Blau zu Orange, was auf eine Siderophorproduktion hinweist. Für die Quantifizierung der gesamten Siderophore wurden bakterielle Überstände zu gleichen Teilen mit CAS-Farbstoff in einer Mikrotiterplatte gemischt, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 630 nm. Pyoverdin wurde direkt aus dem bakteriellen Überstand quantifiziert, indem es zu gleichen Teilen mit 50 mM Tris-HCl gemischt wurde, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse. Ein Peak bei 380 nm bestätigte das Vorhandensein von Pyoverdin. Was Pyochelin betrifft, so war eine direkte Quantifizierung aus dem bakteriellen Überstand nicht möglich, so dass es zuerst extrahiert werden musste. Die anschließende spektrophotometrische Analyse ergab das Vorhandensein von Pyochelin mit einem Peak bei 313 nm.
Introduction
Organismen benötigen Eisen, um verschiedene lebenswichtige Funktionen zu erfüllen, wie z. B. den Elektronentransport und die DNA-Replikation1. Es ist bekannt, dass Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegativer opportunistischer Erreger, eine Vielzahl von Virulenzfaktoren besitzt, um eine Infektion im Wirt zu etablieren, von denen ein Mechanismus die Siderophorbildungist 2. Unter eisenabbauenden Bedingungen setzt P. aeruginosa spezialisierte Moleküle frei, die als Siderophore bezeichnet werden und Eisen aus der Umgebung abschrecken. Siderophore chelatieren Eisen extrazellulär, und der resultierende Eisen-Siderophor-Komplex wird aktiv zurück in die Zelletransportiert 3.
Es ist bekannt, dass P. aeruginosa zwei Siderophore, Pyoverdin und Pyochelin, produziert. Es ist bekannt, dass Pyoverdin eine höhere Eisenchelat-Affinität (1:1) hat, während Pyochelin eine geringere Eisen-Chelat-Affinität (2:1)4 aufweist. Pyochelin wird auch als sekundärer Siderophor bezeichnet, da es eine geringere Eisenchelataffinität aufweist5. Die Produktion und Regulation von Siderophoren wird aktiv durch Quorum Sensing (QS)-Systeme in P. aeruginosa6 gesteuert.
Neben der Eisenlöschung sind Siderophore auch an der Regulation von Virulenzfaktoren beteiligt und spielen eine aktive Rolle bei der Biofilmbildung7. Siderophore erfüllen weitere wichtige Rollen, darunter die Beteiligung an der Zellsignalisierung, die Abwehr von oxidativem Stress und die Erleichterung von Interaktionen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften8. Siderophore werden in der Regel nach den spezifischen funktionellen Gruppen kategorisiert, durch die sie Eisen chelatisieren. Die drei primären zweizähnigen Liganden in dieser Klassifikation sind Catecholat, Hydroxamat und α-Hydroxycarboxylat3. Pyoverdine sind Kennzeichen fluoreszierender Pseudomonas-Arten wie P. aeruginosa und P. fluorescens5. Sie bestehen aus einem gemischten grün fluoreszierenden Chromophor, der an ein Oligopeptid gekoppelt ist, das 6-12 Aminosäuren enthält. An ihrer Synthese sind mehrere nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPs) beteiligt9. Vier Gene, die an der Produktion und Regulation von Pyoverdin beteiligt sind, sind pvdL, pvdI, pvdJ und pvdD10. Pyoverdin ist auch für Infektionen und Virulenz bei Säugetieren verantwortlich11. Es ist bekannt, dass P. aeruginosa Pyochelin unter mäßig eisenlimitierenden Bedingungen produziert, während Pyoverdin unter schweren eisenlimitierenden Umgebungen produziert wird12. Zwei Operone, die an der Pyochelinproduktion beteiligt sind, sind pchDCBA und pchEFGHI13. Es wird darauf hingewiesen, dass Pyochelin (Katecholat) in Gegenwart von Pyocyanin oxidative Schäden und Entzündungen induziert und Hydroxylradikale erzeugt, die für das Wirtsgewebe schädlich sind11.
Der Chrom-Azurolsulfonat-Assay (CAS) ist aufgrund seiner Umfassendheit, seiner hohen Sensitivität und seines größeren Komforts im Vergleich zu mikrobiologischen Assays, die zwar empfindlich, aber überspezifisch sein können, weit verbreitet14. Der CAS-Assay kann auf Agaroberflächen oder in einer Lösung durchgeführt werden. Es beruht auf der Farbänderung, die auftritt, wenn das Eisen-Ion von seinem intensiven blauen Komplex zu orange übergeht. Der kolorimetrische CAS-Assay quantifiziert die Verarmung von Eisen aus einem ternären Fe-CAS-Tensidkomplex. Dieser spezielle Komplex, bestehend aus Metall, organischem Farbstoff und Tensid, hat eine blaue Farbe und weist einen Absorptionspeak bei 630 nm auf.
In diesem Bericht wird eine Methode zum qualitativen Nachweis der Siderophorproduktion vorgestellt, bei der die Produktion von Siderophoren auf einer Agarplatte nachgewiesen werden kann. Eine Methode zur quantitativen Abschätzung der gesamten Siderophorproduktion in einer Mikrotiterplatte und zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von zwei Siderophoren, Pyoverdin und Pyochelin, aus P. aeruginosa wird ebenfalls bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Gesamtzahl der Siderophore und zwei verschiedene Siderophore von P. aeruginosa, nämlich Pyoverdin und Pyochelin, aus dem bakteriellen zellfreien Überstand zu quantifizieren. Im CAS-Agarplatten-Assay bilden der CAS-Farbstoff undFe3+-Ionen einen Komplex. Wenn Bakterien Siderophore produzieren, löschen sieFe-3+-Ionen aus dem CAS-Fe3+-Komplex, was zu einer Farbänderung um das Bakterienwachstum herum führt. Diese Veränderung fü…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für die Finanzierung durch DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program und FIST. MR bedankt sich für das von SHODH erhaltene Stipendium. HP bedankt sich für das vom CSIR erhaltene Stipendium.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referencias
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