Análise Qualitativa e Quantitativa da Produção de Siróforos de Pseudomonas aeruginosa
Summary
Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.
O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe3+-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.
Introduction
Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA1. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos2. Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante é ativamente transportado de volta para a célula3.
P. aeruginosa é conhecida por produzir dois sideróforos, pioverdina e piochelina. Sabe-se que a pioverdina tem maior afinidade quelante de ferro (1:1), enquanto a pioquelina é conhecida por ter menor afinidade quelante de ferro (2:1)4. A pioquelina também é chamada de sideróforo secundário por apresentar menor afinidade quelante ao ferro5. A produção e regulação de sideróforos são ativamente controladas por sistemas Quorum Sensing (QS) em P. aeruginosa6.
Além da têmpera do ferro, os sideróforos também estão envolvidos na regulação dos fatores de virulência e desempenham um papel ativo na formação do biofilme7. Os sideróforos desempenham funções cruciais adicionais, incluindo envolvimento na sinalização celular, defesa contra o estresse oxidativo e facilitação de interações entre comunidades microbianas8. Os sideróforos são tipicamente categorizados com base nos grupos funcionais específicos através dos quais eles quelatam ferro. Os três ligantes bidentados primários nesta classificação são catecolato, hidroxamato e α-hidroxicarboxilato3. Pioverdinas são características de espécies fluorescentes de Pseudomonas, como P. aeruginosa e P. fluorescens5. Eles consistem de um cromóforo fluorescente verde misto acoplado a um oligopeptídeo contendo 6-12 aminoácidos. Várias sintetases peptídicas não ribossomais (NRPs) estão envolvidas em sua síntese9. Quatro genes envolvidos na produção e regulação da pioverdina são pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD10. A pioverdina também é responsável pela infecção e virulência em mamíferos11. Observa-se que a P. aeruginosa produz pioquelina em condições moderadas limitantes de ferro, enquanto a pioverdina é produzida durante ambientes limitantes severos de ferro12. Dois operons envolvidos na produção de pioquelina são pchDCBA e pchEFGHI13. Nota-se que, na presença de piocianina, a pioquelina (catecolato) induz dano oxidativo e inflamação e gera radicais hidroxila, que são prejudiciais aos tecidos do hospedeiro11.
O ensaio Chrome Azurol Sulfonate (CAS) é amplamente adotado devido à sua abrangência, alta sensibilidade e maior conveniência em comparação com ensaios microbiológicos, que, embora sensíveis, podem ser excessivamente específicos14. O ensaio CAS pode ser realizado em superfícies de ágar ou em solução. Ele depende da mudança de cor que ocorre quando o íon férrico faz a transição de seu intenso complexo azul para laranja. O ensaio colorimétrico CAS quantifica a depleção de ferro de um complexo ternário Fe-CAS-surfactante. Este complexo particular, consistindo de metal, corante orgânico e surfactante, tem uma cor azul e exibe um pico de absorção em 630 nm.
Este trabalho apresenta um método para a detecção qualitativa da produção de sideróforos, onde se pode detectar a produção de sideróforos em uma placa de ágar. Um método para a estimativa quantitativa da produção total de sideróforos em uma placa de microtitulação e a detecção e análise quantitativa de dois sideróforos, pioverdina e piochelina, de P. aeruginosa, também é fornecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe3+ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe3+ do complexo CAS-Fe3+, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em ha…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o financiamento do DBT – Programa de Ensino em Biotecnologia, do DBT – Programa BUILDER e do FIST. MR agradece a bolsa recebida da SHODH. HP agradece bolsa recebida da CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Referencias
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