半発酵無菌食によるAxenic Delia antiqua の飼育
Summary
半発酵無菌食でアキセニック デリアアンティクア を飼育するための簡単な手順が説明されています。PCRを用いて、Axenic D. antiqua の各星から1つのボルバキア株のみが検出された。
Abstract
抈性昆虫は、無菌培地を使用した無菌人工飼育システムから得られます。これらの昆虫は、サイズが小さく、成長サイクルが短く、飼料要件が少ないことを特徴とし、微生物と宿主の関係を研究するのに理想的です。腸内細菌叢は宿主昆虫の生理学的特性に大きく影響し、特定の菌株を軸性昆虫に導入することで、腸内細菌の機能を検証する方法を提供します。双翅目、Anthomyiidae科、およびDelia属の脅威となる害虫である Delia antiquaは、主にタマネギ、ニンニク、ネギ、およびユリ科の他の野菜を食べます。幼虫は球根を食べ、植物全体を腐らせたり、しおれたり、枯れさせたりします。軸幼虫を飼育することで、腸内細菌叢が D. antiquaの成長と発達に及ぼす影響を観察するための追跡調査を行うことができます。抗生物質による関連微生物の除去を含む方法とは異なり、本稿では、アキセニック D.antiquaを飼育するための低コストで高効率なアプローチを紹介します。 D. antiqua 卵の表面殺菌後、半発酵無菌飼料を用いて幼虫を飼育し、培養依存性および培養非依存性アッセイにより D. antiqua の軸の状態を検証しました。結論として、昆虫の卵の滅菌と幼虫培養のための無菌飼料の調製の組み合わせにより、アキセニック D.アンティクアを得るための効率的で簡単な方法の開発が可能になりました。この方法は、昆虫と微生物叢の相互作用を研究するための強力なアプローチを提供します。
Introduction
生菌や寄生虫が検出されない動物として定義される軸動物は、宿主と微生物の相互作用を研究するための貴重な実験モデルです1,2。無脊椎動物の最大のグループである昆虫は、微生物と共生関係を形成することができます3。軸性昆虫は、共生系における宿主と共生生物の相互作用を研究するために使用できます4。例えば、西出ら5は、悪臭を放つ線虫Plautia staliの実用的な無菌飼育手順を確立し、モデル共生システムにおける宿主と共生生物の相互作用の信頼性の高い厳密な解析を可能にしました。扈虫は、卵期を殺菌し、幼虫と成虫に無菌の餌を与えることによって生産することができる6,7。扈虫は非常に重要であり、生物学研究で広く使用されています。例えば、Somervilleらが実施した研究では、エンテロバクター・クロアカエを接種したダイアモンドバック蛾がトランスジェニックオスの適応性を向上させることが実証されました。
Delia antiqua Meigenは、世界中のタマネギやその他のユリ科作物の経済的に重要な害虫であり、その幼虫はタマネギや他のユリ科作物の球根に損傷を与えます9。D. antiquaは主に温暖な気候で見られ、アメリカ大陸、ヨーロッパ、アジアのタマネギ栽培地域に広く分布しています。適切に管理しないと、タマネギ(Allium cepa L.)、ニンニク(Allium sativum L.)、エシャロット(Allium fistulosum L.)、ネギ(Alliumchoenoprasum L.)の作物が50%から100%の範囲で失われる可能性があります10,11。幼虫は植物の地下部分を食べ、この餌は苗を萎れさせ、やがて枯れてしまいます。さらに、損傷した植物は病原体の侵入を許し、球根の腐敗につながる可能性があります12。幼虫が完全に食べていなくても、幼虫が引き起こす被害により、タマネギは市場に出回らなくなり、経済的損失につながります。
昆虫は腸内細菌叢と密接に関連しており、ほとんどの昆虫の腸には、宿主が提供する栄養素で繁殖するさまざまな共生細菌が含まれています13,14。Jingら15は、腸内共生群集の主な機能は必須栄養素を提供することであり、消化と解毒に関連する機能が続くことを示しました。場合によっては、腸内細菌は害虫管理の目的で微生物資源として役立つ可能性があります。したがって、D. antiquaの体内における個々の腸内細菌の性能と特定の機能を研究することが望ましい。したがって、アキセン幼虫の調製は、特定の細菌株と昆虫との相互作用を研究するために特に重要である16。現在、昆虫の腸内細菌を除去するために一般的に使用されている方法は、関連する微生物を根絶するための抗生物質の組み合わせの使用です17,18,19。微生物の数を減らすことしかできない抗生物質のみを使用するのとは異なり、昆虫の軸飼育は微生物の組成と量を制御できるため、腸内細菌叢の機能をより正確に検証できます。
そこで、本稿では、アキセニック D.アンティクアを調製・飼育するためのプロトコルについて紹介する。アキセン幼虫の餌は、半発酵食品と組み合わせた自然飼料の高温殺菌を利用することによって得られます。卵は、軸卵を得るための実験プロトコルに従って滅菌され、最後に、軸子の幼虫が軸の卵から培養されます。アキセニック飼育システムは、実験のために1世代だけ実施されました。これは、昆虫と腸内細菌叢の相互作用を研究するのに便利です。
Protocol
Representative Results
Discussion
昆虫は非常に複雑な腸内細菌叢を持っているため20,21、昆虫と微生物の相互作用を研究するには、特定の腸内細菌株を接種した軸性昆虫を使用する必要があります。このような研究活動には、アキセニウムシの作製が不可欠です。抗生物質治療は、腸内細菌叢を排除するために使用される方法です。例えば、JungとKim22はSpodoptera …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(32272530)、済南大学新20政策プロジェクト(2021GXRC040)、山東省主要科学技術イノベーションプロジェクト(2021TZXD002)、啓魏理工大学科学教育統合プロジェクト(2022PYI009、2022PY016、2022PT105)の支援を受けました。
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referencias
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
