Axenic Delia antiqua'nın Yarı Fermente Steril Diyetlerle Yetiştirilmesi
Summary
Yarı fermente steril diyetlerle axenic Delia antiqua yetiştirmek için basit bir prosedür tarif edilmiştir. PCR kullanılarak her bir aksenik D. antiqua instarında sadece bir Wolbachia suşu tespit edildi.
Abstract
Aksenik böcekler, steril ortam kullanılarak steril yapay yetiştirme sistemlerinden elde edilir. Küçük boyutları, kısa büyüme döngüleri ve düşük yem gereksinimleri ile karakterize edilen bu böcekler, mikroorganizmalar ve konakçılar arasındaki ilişkiyi incelemek için idealdir. Bağırsak mikrobiyotası, böcek konakçılarının fizyolojik özelliklerini önemli ölçüde etkiler ve aksenik böceklere spesifik suşların sokulması, bağırsak mikrobiyal fonksiyonlarını doğrulamak için bir yöntem sağlar. Diptera, Anthomyiidae familyası ve Delia cinsinde tehdit edici bir haşere olan Delia antiqua, öncelikle soğan, sarımsak, pırasa ve Liliaceae familyasının diğer sebzeleriyle beslenir. Larvaları ampullerle beslenerek tüm bitkilerin çürümesine, solmasına ve hatta ölümüne neden olur. Aksenik larvaları yetiştirerek, bağırsak mikroflorasının D. antiqua’nın büyümesi ve gelişmesi üzerindeki etkilerini gözlemlemek için takip çalışmaları yapılabilir. İlişkili mikropların antibiyotik eliminasyonunu içeren yöntemden farklı olarak, bu makale aksenik D. antiqua’nın yükseltilmesi için düşük maliyetli ve yüksek verimli bir yaklaşım sunmaktadır. D. antiqua yumurtalarının yüzey sterilizasyonundan sonra, larvaları yetiştirmek için yarı fermente steril diyetler kullanıldı ve D. antiqua’nın aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız deneylerle doğrulandı. Sonuç olarak, böcek yumurtası sterilizasyonu ve larva kültürü için steril diyetlerin hazırlanmasının kombinasyonu, aksenik D. antiqua elde etmek için etkili ve basit bir yöntemin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntem, böcek-mikroflora etkileşimlerini incelemek için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Canlı mikroorganizma veya parazitlerin tespit edilemediği hayvanlar olarak tanımlanan aksenik hayvanlar, konakçı-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için değerli deneysel modellerdir 1,2. En büyük omurgasız grubu olan böcekler, mikroorganizmalarla simbiyotik ilişkiler kurabilir3. Aksenik böcekler, simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir4. Örneğin, Nishide ve ark.5, kötü kokulu solucan Plautia stali için pratik bir steril yetiştirme prosedürü oluşturarak, model simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerinin güvenilir ve titiz bir şekilde analiz edilmesini sağlamıştır. Aksenik böcekler, yumurta aşamasını sterilize ederek ve larvalara ve yetişkinlere steril gıda sağlayarak üretilebilir 6,7. Aksenik böcekler büyük önem taşır ve biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır. Örneğin, Somerville ve ark.8 tarafından yapılan bir araştırma, Enterobacter cloacae ile aşılanmış elmas sırtlı güvelerin transgenik erkeklerin adaptasyonunu geliştirdiğini göstermiştir.
Delia antiqua Meigen, dünya çapında soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin ekonomik açıdan önemli bir zararlısıdır ve larvaları soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin soğanlarına zarar verir9. D. antiqua esas olarak ılıman iklimlerde bulunur ve Amerika, Avrupa ve Asya’nın soğan yetiştirme alanlarında yaygındır. Uygun şekilde kontrol edilmezse soğan (Allium cepa L.), sarımsak (Allium sativum L.), arpacık soğanı (Allium fistulosum L.) ve pırasada (Alliumchoenoprasum L.) %50 ile %100 arasında değişen ürün kayıplarına neden olabilir10,11. Larvalar bitkilerin toprak altı kısımlarında beslenir ve bu beslenme fidelerin solmasına ve sonunda ölmesine neden olur. Ek olarak, hasarlı bitkiler patojenlerin girmesine izin vererek ampul çürümesineneden olabilir 12. Bitkiler larvalar tarafından tamamen tüketilmese bile verdikleri zararlar soğan bitkilerini pazarlanamaz hale getirmekte ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Böcekler bağırsak mikrobiyotası ile yakından ilişkilidir ve çoğu böcek bağırsağı, konakçı tarafından sağlanan besinlerle gelişen çeşitli simbiyotik bakteriler içerir13,14. Jing ve ark.15, bağırsak simbiyotik topluluğunun birincil işlevinin temel besinleri sağlamak olduğunu, ardından sindirim ve detoksifikasyon ile ilgili işlevlerin geldiğini göstermiştir. Bazı durumlarda, bağırsak bakterileri haşere yönetimi amacıyla mikrobiyal bir kaynak görevi görebilir. Sonuç olarak, bireysel bağırsak bakterilerinin performanslarını ve D. antiqua’nın vücudundaki spesifik işlevlerini incelemek arzu edilir. Bu nedenle, aksenik larvaların hazırlanması, spesifik bakteri suşları ve böcekler arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle önemlidir16. Şu anda, böcek bağırsak bakterilerini ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, ilişkili mikropları yok etmek için bir antibiyotik kombinasyonunun kullanılmasıdır 17,18,19. Sadece mikrobiyal sayıları azaltabilen tek başına antibiyotik kullanmanın aksine, böceklerin aksenik yetiştirilmesi, mikroorganizmaların bileşimi ve miktarı üzerinde kontrol sağlayarak bağırsak mikrobiyota işlevselliğinin daha doğru bir şekilde doğrulanmasını sağlar.
Bu nedenle, bu makale axenic D. antiqua’nın hazırlanması ve yetiştirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Aksenik larva yemi, yarı fermente gıdalarla birlikte doğal diyetlerin yüksek sıcaklıkta sterilizasyonu kullanılarak elde edilir. Yumurtalar, aksenik yumurtalar elde etmek için deneysel bir protokol izlenerek sterilize edilir ve son olarak, aksenik larvalar aksenik yumurtalardan kültürlenir. Aksenik yetiştirme sistemi, deney için sadece bir nesil boyunca gerçekleştirildi. Bu, böcekler ve bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimi incelemek için kolaylık sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Böcekler oldukça karmaşık bir bağırsak mikrobiyotasına20,21 sahiptir ve böcek-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için spesifik bağırsak mikrobiyal suşları ile aşılanmış aksenik böceklerin kullanılmasını gerektirir. Aksenik böceklerin hazırlanması bu tür araştırma çabaları için çok önemlidir. Antibiyotik tedavisi, bağırsak mikrobiyotasını ortadan kaldırmak için kullanılan bir yöntemdir. Örneğin, Jung ve Kim<sup clas…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32272530), Jinan’daki Üniversite için Yeni Yirmi Politika Projesi (2021GXRC040), Shandong Eyaletindeki Büyük Bilimsel ve Teknolojik İnovasyon Projeleri (2021TZXD002) ve Qilu Teknoloji Üniversitesi Bilim ve Eğitim Entegrasyon Projesi (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referencias
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
