تربية أكسينيك ديليا أنتيكا مع الوجبات الغذائية المعقمة نصف المخمرة
Summary
تم وصف إجراء بسيط لتربية أكسينيك ديليا أنتيكا مع الوجبات الغذائية المعقمة نصف المخمرة. تم الكشف عن سلالة Wolbachia واحدة فقط في كل من النجوم من Axenic D. antiqua باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Abstract
يتم الحصول على الحشرات المحورية من أنظمة التربية الاصطناعية المعقمة باستخدام وسائط معقمة. هذه الحشرات ، التي تتميز بصغر حجمها ، ودورة نموها القصيرة ، ومتطلبات التغذية المنخفضة ، مثالية لدراسة العلاقة بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. تؤثر ميكروبيوتا الأمعاء بشكل كبير على الخصائص الفسيولوجية لمضيفات الحشرات ، ويوفر إدخال سلالات معينة في الحشرات المحورية طريقة للتحقق من وظائف ميكروبات الأمعاء. Delia antiqua ، وهي آفة مهددة في رتبة Diptera ، وعائلة Anthomyiidae ، وجنس Delia ، تتغذى بشكل أساسي على البصل والثوم والكراث والخضروات الأخرى من عائلة Liliaceae. تتغذى يرقاتها على المصابيح ، مما يتسبب في تعفن وذبول وحتى موت نباتات بأكملها. من خلال تربية اليرقات المحورية ، يمكن إجراء دراسات متابعة لمراقبة آثار البكتيريا المعوية على نمو وتطور D. antiqua. على عكس الطريقة التي تنطوي على القضاء على المضادات الحيوية من الميكروبات المرتبطة بها ، تقدم هذه المقالة نهجا منخفض التكلفة وعالي الكفاءة لرفع axenic D. antiqua. بعد التعقيم السطحي لبيض D. antiqua ، تم استخدام وجبات معقمة نصف مخمرة لتربية اليرقات ، وتم التحقق من الحالة المحورية ل D. antiqua من خلال المقايسات المعتمدة على الثقافة والمستقلة عن الثقافة. في الختام ، فإن الجمع بين تعقيم بيض الحشرات وإعداد الوجبات الغذائية المعقمة لتربية اليرقات قد مكن من تطوير طريقة فعالة وبسيطة للحصول على axenic D. antiqua. توفر هذه الطريقة نهجا قويا لدراسة تفاعلات الحشرات والبكتيريا.
Introduction
المحورية ، التي تعرف بأنها لا يمكن فيها اكتشاف كائنات دقيقة أو طفيليات قابلة للحياة ، هي نماذج تجريبية قيمة لدراسة تفاعلات الكائنات الحية الدقيقة المضيفة 1,2. الحشرات ، أكبر مجموعة من اللافقاريات ، يمكن أن تشكل علاقات تكافلية مع الكائنات الحية الدقيقة3. يمكن استخدام الحشرات المحورية لدراسة تفاعلات المضيف والتعايش في الأنظمة التكافلية4. على سبيل المثال ، أنشأ Nishide et al.5 إجراء عمليا لتربية الدودة ذات الرائحة الكريهة Plautia stali ، مما يتيح تحليلا موثوقا ودقيقا للتفاعلات بين المضيف والمتعايش في الأنظمة التكافلية النموذجية. يمكن إنتاج الحشرات المحورية عن طريق تعقيم مرحلة البيض وتوفير الغذاء المعقم لليرقات والبالغين 6,7. الحشرات المحورية لها أهمية كبيرة وتستخدم على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. على سبيل المثال ، أظهرت دراسة أجراها Somerville et al.8 أن عث الماس الخلفي الملقح ب Enterobacter cloacae يحسن قدرة الذكور المعدلة وراثيا على التكيف.
Delia antiqua Meigen هي آفة مهمة اقتصاديا للبصل ومحاصيل Liliaceae الأخرى في جميع أنحاء العالم ، حيث تلحق يرقاتها الضرر ببصيلات البصل ومحاصيل Liliaceae الأخرى9. توجد D. antiqua بشكل رئيسي في المناخات المعتدلة وتنتشر على نطاق واسع في مناطق زراعة البصل في الأمريكتين وأوروبا وآسيا. إذا لم يتم التحكم فيه بشكل صحيح ، يمكن أن يتسبب في خسائر في المحاصيل في البصل (Allium cepa L.) ، والثوم (Allium sativum L.) ، والكراث (Allium fistulosum L.) ، والكراث (Alliumchoenoprasum L.) تتراوح من 50٪ إلى 100٪ 10,11. تتغذى اليرقات على الأجزاء الموجودة تحت الأرض من النباتات ، وتتسبب هذه التغذية في ذبول الشتلات وموتها في النهاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للنباتات التالفة أن تسمح لمسببات الأمراض بالدخول ، مما يؤدي إلى تعفن المصباح12. حتى لو لم تستهلك اليرقات النباتات بالكامل ، فإن الضرر الذي تسببه يجعل نباتات البصل غير قابلة للتسويق ويؤدي إلى خسائر اقتصادية.
ترتبط الحشرات ارتباطا وثيقا بميكروبات الأمعاء ، وتحتوي معظم أمعاء الحشرات على مجموعة متنوعة من البكتيريا التكافلية التي تزدهر على العناصر الغذائية التي يوفرها المضيف13,14. أظهر Jing et al.15 أن الوظيفة الأساسية للمجتمع التكافلي المعوي هي توفير العناصر الغذائية الأساسية ، تليها الوظائف المتعلقة بالهضم وإزالة السموم. في بعض الحالات ، يمكن أن تعمل بكتيريا الأمعاء كمورد ميكروبي لأغراض إدارة الآفات. وبالتالي ، فإن دراسة أداء بكتيريا الأمعاء الفردية ووظائفها المحددة داخل جسم D. antiqua أمر مرغوب فيه. لذلك ، فإن تحضير اليرقات المحورية مهم بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين سلالات بكتيرية معينة والحشرات16. حاليا ، هناك طريقة شائعة الاستخدام للقضاء على بكتيريا الأمعاء الحشرية وهي استخدام مزيج مضاد حيوي للقضاء على الميكروبات المرتبطة17،18،19. على عكس استخدام المضادات الحيوية وحدها ، والتي يمكن أن تقلل فقط من أعداد الميكروبات ، فإن التربية المحورية للحشرات تسمح بالتحكم في تكوين وكمية الكائنات الحية الدقيقة ، مما يتيح التحقق بشكل أكثر دقة من وظائف ميكروبات الأمعاء.
وبالتالي ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإعداد وتربية axenic D. antiqua. يتم الحصول على غذاء اليرقات Axenic من خلال استخدام التعقيم بدرجة حرارة عالية من الوجبات الغذائية الطبيعية جنبا إلى جنب مع الأطعمة نصف المخمرة. يتم تعقيم البيض باتباع بروتوكول تجريبي للحصول على بيض أكسيني ، وأخيرا ، يتم استزراع يرقات الأكسنيك من بيض المحور. تم تنفيذ نظام التربية المحورية لجيل واحد فقط للتجربة. سيوفر هذا الراحة لدراسة التفاعل بين الحشرات وميكروبات الأمعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمتلك الحشرات ميكروبيوتا الأمعاءالمعقدة للغاية 20،21 ، مما يستلزم استخدام الحشرات المحورية الملقحة بسلالات ميكروبية معوية محددة لدراسة تفاعلات الحشرات والكائنات الحية الدقيقة. يعد تحضير الحشرات المحورية أمرا بالغ الأهمية لمثل هذه المساعي البحثية. العلاج …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32272530) ، ومشروع السياسات العشرين الجديدة للجامعة في جينان (2021GXRC040) ، ومشاريع الابتكار العلمي والتكنولوجي الرئيسية في مقاطعة شاندونغ (2021TZXD002) ، ومشروع تكامل العلوم والتعليم بجامعة تشيلو للتكنولوجيا (2022PYI009 ، 2022PY016 ، 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Referencias
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
