Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo
Summary
Este video muestra todo inmunohistoquímica montaje, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de un antígeno puede ser visualizado en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell.
Abstract
El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo convierten en una herramienta ideal para estudiar la expresión de anticuerpos en el desarrollo del cerebro, del tubo neural y somitas. Este video muestra las diferentes etapas de la tinción de anticuerpos todo el montaje con HRP secundaria anticuerpos conjugados, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. Peroxidasa en segundo lugar, endógena se inactiva, el embrión se expone a anticuerpo primario. Después de varios lavados, el embrión se incuba con el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Actividad de la peroxidasa se reveló mediante la reacción con el sustrato diaminobencidina. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para la fotografía y el corte. La ventaja de este método sobre el uso de anticuerpos fluorescentes es que los embriones pueden ser procesados por el corte de cera, lo que permite el estudio de los sitios de antígeno en la sección transversal. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
Discussion
Este video muestra los diferentes pasos en la realización de todo el montaje la tinción de anticuerpos en embriones de pollo joven. Este protocolo se utiliza esencialmente para la caracterización espacial y temporal de nuevos anticuerpos en el pollito 2,3, así como para el uso de los marcadores antigénicos conocidos para determinar malformación embrionaria después de insultar 4.
Acknowledgements
Los anticuerpos monoclonales (15.3B9, PAX7) desarrollado por (J. Dodd, TM Jessell y Kawakami A.) se obtuvieron de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas , Iowa. DP es receptor de Ruth Premio Kirschstein DA021977 1F32-01A1 del Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Otro | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
Referencias
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
