FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

Summary

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM 4〜64で標識された小胞のリアルタイムイメージングを使用していました。

Abstract

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、シナプス小胞放出の速度を監視するためのFM色素で標識された小胞のリアルタイムイメージングを使用していました。 FM4 – 64は、エンドサイトーシスを刺激されているシナプス小胞の膜に埋め込まれて赤色蛍光両親媒性のスチリル色素です。親油性の相互作用は、色素が大きく従って小胞と公称細胞外液に関連付けられている明るいシグナルを発し、蛍光の増加を引き起こす。洗浄工程が細胞膜内に外部色素を除去するために使用された後、残りのFMは、小胞内に濃縮し、その後、エキソサイトーシスは、電気刺激の別のラウンドにより誘導されたときに排出されます。小胞の放出速度は、蛍光の結果減少から測定されます。 FM色素が外部と一時的に適用できるので、それは、トランスフェクションしたシナプスと隣接する制御boutons間の金利を比較する場合は特に、ニューロン培養でエキソサイトーシスの速度を決定するための便利なツールです。

Protocol

細胞：ラット（またはマウス）の主海馬ニューロン培養（in vitroで14から28日間）。 刺激：電気、二つの白金電極を介して配信、70から90 mVの顕微鏡：倒立CCD蛍光顕微鏡で60倍の油レンズ。 ソフトウェア：Slidebook（インテリジェントイメージングイノベーション、サンタモニカ、カリフォルニア州） 詳細に?…

Discussion

小胞のリサイクルの少なくとも一つのラウンドを誘導するのに十分である300活動電位（AP）のように、300台のAPまたは複数のローディング刺激は、しばしば小胞のリサイクルプールにラベルを付けるために与えられます。など900のAPのようなより強いローディング刺激が、、標識する追加の小胞の名目上の数を可能にするかもしれないが、これはまた、より非特異的な染色につながる、色素は細胞外膜に埋め?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
APV		Sigma	A5282
FM 4-64		Molecular Probes	T-3166
CNQX disodium salt		Sigma	C-239