Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM
Summary
A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.
Abstract
A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com corante FM para monitorar a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas. FM4-64 é um corante vermelho anfifílicos fluorescentes styryl que incorpora nas membranas das vesículas sinápticas como endocitose é estimulado. Interações lipofílicas fazer com que a tintura para aumentar grandemente a fluorescência, assim emitindo um sinal luminoso quando associada a vesículas e uma nominal quando no líquido extracelular. Após uma etapa de lavagem é usado para ajudar a remover corante externa dentro da membrana plasmática, a FM restante é concentrado dentro das vesículas e depois é expelido quando exocitose é induzida por outra rodada de estimulação elétrica. A taxa de liberação de vesículas é medido a partir da queda da fluorescência. Desde FM coloração pode ser aplicada externa e transitoriamente, é uma ferramenta útil para determinar as taxas de exocitose em culturas de neurônios, especialmente quando se comparam as taxas entre as sinapses e transfectadas boutons controlo vizinhas.
Protocol
Discussion
De 300 potenciais de ação (APs) é suficiente para induzir, pelo menos, uma rodada de reciclagem de vesícula, um estímulo de carga de 300 ou mais APs muitas vezes é dado para rotular a piscina de reciclagem de vesículas. Apesar de estímulos de carga mais intensa, tais como 900 APs, pode permitir que um número nominal de vesículas adicional a ser rotulados, isso também aumenta a quantidade de tempo que o corante pode incorporar nas membranas extracelulares, levando a uma maior coloração não específica. Eu encontrei a etapa de l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
