Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling
Summary
Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.
Abstract
Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit FM-Farbstoff markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release zu überwachen. FM4-64 ist ein rot fluoreszierendes amphiphilen Styryl-Farbstoff, der in den Membranen von synaptischen Vesikeln bettet als Endozytose wird angeregt. Lipophile Wechselwirkungen verursachen den Farbstoff stark in der Fluoreszenz zu erhöhen, damit emittierende ein helles Signal, wenn mit Bläschen und eine Höchstdauer von einer, wenn in der extrazellulären Flüssigkeit verbunden. Nach einem Waschschritt wird zur Beseitigung von externen Farbstoff innerhalb der Plasmamembran, die restlichen FM in den Vesikeln konzentriert und ist dann ausgeschlossen, wenn Exozytose durch eine weitere Runde der elektrischen Stimulation induziert wird. Die Rate der Vesikel Release ist aus dem resultierenden Abnahme der Fluoreszenz gemessen. Da FM Farbstoff kann angewendet werden, externe und transient, es ist ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung Preise der Exozytose in neuronalen Kulturen, vor allem beim Vergleich der Preise zwischen transfizierten Synapsen und benachbarten Kontrolle boutons.
Protocol
Discussion
AS 300 Aktionspotentiale (APs) ausreicht, um mindestens eine Runde von Vesikel-Recycling, ein Be-Stimulus von 300 APs oder mehr wird oft zur Kennzeichnung der Recycling-Pool von Vesikeln gegeben induzieren. Obwohl intensiver Belastung Reize, z. B. 900 APs, eine nominale Anzahl von zusätzlichen Vesikel gekennzeichnet werden können kann, erhöht dies auch die Zeit, die den Farbstoff in extrazelluläre Membranen eingebettet werden können, was zu mehr nicht-spezifische Färbung. Ich habe den Waschschritt, kritisch zu sein, um eine ordnungsge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
