Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Summary

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Abstract

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada FM boya ile etiketlenmiş veziküller presinaptik vezikül bırakma oranı izlemek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır. FM4-64 endositoz uyarılmış olarak sinaptik veziküllerin membranlar içine gömer kırmızı floresan amfifilik styryl boya. Lipofilik etkileşimleri boya büyük veziküller ve nominal bir ekstrasellüler sıvı ile ilişkili böylece parlak bir sinyal yayan floresan artışa neden olur. Yıkama adım, plazma zarı içinde dış boya kaldırmanıza yardımcı kullanıldıktan sonra, kalan FM veziküller içinde yoğunlaşmıştır ve ekzositoz, elektrik stimülasyonu başka bir yuvarlak ile indüklenen zaman sonra atılır. Floresans ortaya çıkan düşüşten vezikül serbest oranı ölçülür. FM boya geçici dış uygulanır ve olabilir bu yana, özellikle transfekte sinaps ve komşu kontrolü BOUTONS arasında oranlarını karşılaştırarak, nöronal kültürlerin ekzositoz oranlarının belirlenmesi için yararlı bir araçtır.

Protocol

Hücreler: Rat (veya fare) primer hipokampal nöron kültürleri (in vitro 14-28 gün). Uyarım: Elektrik, iki platin elektrot ile teslim; 70-90 mV Mikroskopi: ters bir CCD floresan mikroskop 60x petrol objektif. Yazılım: Slidebook (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Santa Monica, CA) Daha fazla ayrıntı için tamamlayıcı yöntemler sayfasına bakınız Warm Hepes-tamponlu salin…

Discussion

300 aksiyon potansiyelleri (AP), vezikül geri dönüşüm en azından bir tur, 300 AP'ler veya daha sık veziküllerin geri dönüşüm havuzu etiket verilir yükleme uyaran ikna etmek için yeterli. 900 AP'ler gibi daha yoğun yükleme uyaranlara, etiketli ek veziküllerin nominal izin verebilir rağmen, bu da daha fazla non-spesifik boyanması için boya ekstrasellüler membranlar gömebilirsiniz süreyi artırır. Ben, doğru destaining sağlamak için kritik bir yıkama adım bulduk. Genellikle 10 için akış hızı dakikada 1…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
APV		Sigma	A5282
FM 4-64		Molecular Probes	T-3166
CNQX disodium salt		Sigma	C-239