न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium constricts और परतों जबकि ट्यूब भ्रूण मस्तिष्कमेरु द्रव (eCSF) भ्रूण मस्तिष्क ventricles के फार्म के साथ भरता है. हम इस निलय इंजेक्शन तकनीक विकसित करने के लिए बेहतर से एक जीवित भ्रूण में neuroepithelial आकार के विपरीत में तरल पदार्थ भरा अंतरिक्ष कल्पना.
Abstract
भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान उचित मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए आवश्यक है. मस्तिष्क ventricles के दिमाग है कि मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ भर रहे हैं के भीतर cavities उच्च संरक्षित कर रहे हैं. Zebrafish में, न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium संकोचनों और परतों की एक श्रृंखला आए जबकि यह मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन में जिसके परिणामस्वरूप तरल पदार्थ के साथ भरता है. आदेश में समझने के लिए निलय गठन की प्रक्रिया, और neuroepithelial आकार में परिवर्तन है कि एक ही समय में होते हैं, हम मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में निलय अंतरिक्ष कल्पना की जरूरत है. हालांकि, पारदर्शी zebrafish भ्रूण की प्रकृति यह निलय अंतरिक्ष से मुश्किल ऊतक अंतर करने के लिए बनाता है. इसलिए, हम एक मस्तिष्क निलय इंजेक्शन तकनीक जहां वेंट्रिकल अंतरिक्ष एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ भरा हुआ है और brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged विकसित की है. brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों तब संसाधित कर रहे हैं और फ़ोटोशॉप में आरोपित हैं. इस तकनीक brightfield छवि में neuroepithelium के आकार की तुलना में, फ्लोरोसेंट रंजक के साथ निलय अंतरिक्ष के दृश्य के लिए अनुमति देता है. Zebrafish में ब्रेन निलय इंजेक्शन जल्दी लार्वा चरणों के माध्यम से 18 घंटे के बाद निषेचन से नियोजित किया जा सकता है. हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है बड़े पैमाने पर अच्छी तरह के रूप में मस्तिष्क morphogenesis म्यूटेंट (1-3) निस्र्पक में मस्तिष्क के वेंट्रिकल गठन और morphogenesis के हमारे अध्ययन में.
Protocol
प्रोटोकॉल भाग 1: microinjection के लिए तैयारी केशिका Sutter उपकरण सुई खींचने का उपयोग सुइयों खींच द्वारा इंजेक्शन के लिए तैयार है. एक फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे टेक्सास रेड Dextran) के साथ सुई भरें. एक micromanipu…
Discussion
हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे zebrafish मस्तिष्क ventricles के विकास में फ्लोरोसेंट रंजक (टेक्सास लाल Dextran) इंजेक्षन करने के लिए. इस विधि के आसपास neuroepithelium के विपरीत में मस्तिष्क के वेंट्रिकल अंतरिक्ष कल्पना करने के ल?…
Acknowledgements
लेखकों के लिए लौरा ऐनी Lowery जो प्रयोगशाला में इस तकनीक विकसित धन्यवाद देना चाहूंगा. एच एस NIHMH70926 द्वारा समर्थित है. जेनिफर Gutzman / CSBi मर्क postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Forceps
Tool
Fine Science Tools
11252-20
Capillary Tubes (needles)
Tools
Frederick Haer and Co.
30-30-1
Agarose-Coated dishes
Tools
Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)
Agarose (50027) Dishes (430166)
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope
Microscope
Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software
Tools
1-200 μ pipette tips
Tools
Tip One, US Scientific
1111-0806
These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop
Image Analysis
Adobe
Embryo Loop
Tools
Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector
Tools
Medical Systems Research Products Harvard Apparatus
PL1-100
Needle Puller
Tools
Sutter Instruments
Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).