Zebrafish ब्रेन निलय इंजेक्शन
Summary
न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium constricts और परतों जबकि ट्यूब भ्रूण मस्तिष्कमेरु द्रव (eCSF) भ्रूण मस्तिष्क ventricles के फार्म के साथ भरता है. हम इस निलय इंजेक्शन तकनीक विकसित करने के लिए बेहतर से एक जीवित भ्रूण में neuroepithelial आकार के विपरीत में तरल पदार्थ भरा अंतरिक्ष कल्पना.
Abstract
भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान उचित मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए आवश्यक है. मस्तिष्क ventricles के दिमाग है कि मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ भर रहे हैं के भीतर cavities उच्च संरक्षित कर रहे हैं. Zebrafish में, न्यूरल ट्यूब गठन के बाद, neuroepithelium संकोचनों और परतों की एक श्रृंखला आए जबकि यह मस्तिष्क वेंट्रिकल गठन में जिसके परिणामस्वरूप तरल पदार्थ के साथ भरता है. आदेश में समझने के लिए निलय गठन की प्रक्रिया, और neuroepithelial आकार में परिवर्तन है कि एक ही समय में होते हैं, हम मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में निलय अंतरिक्ष कल्पना की जरूरत है. हालांकि, पारदर्शी zebrafish भ्रूण की प्रकृति यह निलय अंतरिक्ष से मुश्किल ऊतक अंतर करने के लिए बनाता है. इसलिए, हम एक मस्तिष्क निलय इंजेक्शन तकनीक जहां वेंट्रिकल अंतरिक्ष एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ भरा हुआ है और brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged विकसित की है. brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों तब संसाधित कर रहे हैं और फ़ोटोशॉप में आरोपित हैं. इस तकनीक brightfield छवि में neuroepithelium के आकार की तुलना में, फ्लोरोसेंट रंजक के साथ निलय अंतरिक्ष के दृश्य के लिए अनुमति देता है. Zebrafish में ब्रेन निलय इंजेक्शन जल्दी लार्वा चरणों के माध्यम से 18 घंटे के बाद निषेचन से नियोजित किया जा सकता है. हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है बड़े पैमाने पर अच्छी तरह के रूप में मस्तिष्क morphogenesis म्यूटेंट (1-3) निस्र्पक में मस्तिष्क के वेंट्रिकल गठन और morphogenesis के हमारे अध्ययन में.
Protocol
Discussion
हम इस वीडियो में प्रदर्शन कैसे zebrafish मस्तिष्क ventricles के विकास में फ्लोरोसेंट रंजक (टेक्सास लाल Dextran) इंजेक्षन करने के लिए. इस विधि के आसपास neuroepithelium के विपरीत में मस्तिष्क के वेंट्रिकल अंतरिक्ष कल्पना करने के ल?…
Acknowledgements
लेखकों के लिए लौरा ऐनी Lowery जो प्रयोगशाला में इस तकनीक विकसित धन्यवाद देना चाहूंगा. एच एस NIHMH70926 द्वारा समर्थित है. जेनिफर Gutzman / CSBi मर्क postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
