Zebravis hersenventrikel Injection
Summary
Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.
Abstract
Juiste hersenventrikel vorming tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen nodig is voor een normale hersenfunctie. Brain ventrikels zijn de zeer geconserveerd holtes in de hersenen die zijn gevuld met hersenvocht. In de zebravis, na de vorming neurale buis, de neuroepithelium ondergaat een reeks van vernauwingen en plooien, terwijl het zich vult met vocht wat resulteert in hersenventrikel formatie. Om het proces van het ventrikel en de vorming van neuro-epitheliale vorm van veranderingen die zich voordoen op hetzelfde moment te begrijpen, moesten we een manier om de ventrikel ruimte te visualiseren in vergelijking met het hersenweefsel. Echter, de aard van de transparante zebravis embryo's maakt het moeilijk om het weefsel te onderscheiden van de hartkamer ruimte. Daarom ontwikkelden we een hersenventrikel injectie techniek waarbij het ventrikel ruimte is gevuld met een fluorescerende kleurstof en afgebeeld door helderveld en fluorescentie microscopie. De helderveld en de fluorescerende beelden worden vervolgens verwerkt en bovenop in Photoshop. Deze techniek zorgt voor visualisatie van de ventrikel ruimte met de fluorescerende kleurstof, in vergelijking met de vorm van de neuroepithelium in de helderveld beeld. Hersenventrikel injectie in de zebravis kan worden toegepast vanaf 18 uur na de bevruchting tot begin larvale stadia. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek op grote schaal in onze studie van de hersenen ventrikel vorming en morfogenese evenals in het karakteriseren van de hersenen morfogenese mutanten (1-3).
Protocol
Discussion
In deze video laten we zien hoe de fluorescente kleurstof (Texas-Rood Dextran) te injecteren in de ontwikkeling van de hersenen zebravis ventrikels. Deze methode wordt gebruikt om de hersenen ventrikel ruimte in tegenstelling tot de omringende neuroepithelium te visualiseren en is uiterst nuttig voor het bepalen van de vorm van de hartkamer ruimte en de vorm van het omliggende hersenweefsel. Het stelt ons in staat beter te begrijpen van het proces van de hersenen ventrikel vorming en de hersenen morfogenese loop van de …
Acknowledgements
De auteurs willen graag Laura Anne Lowery, die deze techniek ontwikkeld in het lab bedanken. HS wordt ondersteund door NIHMH70926. Jennifer Gutzman werd gesteund door de CSBi / Merck postdoctoraal fellowship.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
