Summary
Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.
Abstract
Formação adequada do ventrículo do cérebro durante o desenvolvimento embrionário do cérebro é necessário para a função cerebral normal. Ventrículos cerebrais são as cavidades altamente conservadas dentro do cérebro que são preenchidos com fluido cerebrospinal. Em peixes-zebra, após a formação do tubo neural, o neuroepitélio sofre uma série de constrições e dobras, enquanto ele se enche de fluido, resultando na formação de ventrículo cerebral. A fim de compreender o processo de formação do ventrículo, e as mudanças que ocorrem neuroepiteliais forma, ao mesmo tempo, precisávamos de uma forma de visualizar o espaço do ventrículo em comparação com o tecido cerebral. No entanto, a natureza de embriões zebrafish transparente torna difícil diferenciar o tecido do espaço ventrículo. Por isso, desenvolvemos uma técnica de injeção ventrículo cerebral onde o espaço de ventrículo é preenchido com um corante fluorescente e fotografada pela claro e microscopia de fluorescência. O claro e as imagens fluorescentes são então processadas e sobrepostos no Photoshop. Esta técnica permite a visualização do espaço do ventrículo com o corante fluorescente, em comparação com a forma do neuroepitélio na imagem de campo claro. Injeção cérebro ventrículo no peixe-zebra pode ser empregado a partir de 18 horas após a fecundação até o início fases larval. Temos utilizado esta técnica extensivamente em nossos estudos de formação do cérebro do ventrículo e morfogênese, bem como na caracterização de mutantes cérebro morfogênese (1-3).
Protocol
Discussion
Neste vídeo demonstramos como injetar corante fluorescente (Texas-Red Dextran) no desenvolvimento de ventrículos cerebrais zebrafish. Este método é usado para visualizar o espaço do ventrículo cerebral em contraste com a neuroepitélio circundante e é extremamente útil para determinar a forma do espaço ventrículo, bem como a forma do tecido cerebral circundante. Ela nos permite compreender melhor o processo de formação do cérebro e morfogênese do ventrículo cerebral ao longo do tempo no embrião vivo. Est…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Laura Anne Lowery, que desenvolveu essa técnica no laboratório. HS é suportada por NIHMH70926. Jennifer Gutzman foi apoiado pelo companheirismo CSBI / Merck pós-doutorado.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
