Summary

Hasat ve hazırlanması Drosophila Embriyolar

Published: May 20, 2009
doi:

Summary

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Abstract

Drosophila, embriyonik gelişim ve fonksiyonel nörobilim çalışma için önde gelen genetik bir model . Geleneksel olarak, bu alanlar, büyük ölçüde bağımsız geçmişleri ve bilimsel topluluklar ile, birbirinden tamamen izole edilir. Ancak, bunlar genellikle birbirinden farklı alanlar arasında arayüz fonksiyonel elektriksel sinyal özellikleri ve nöral devre oluşumu son aşamalarında fonksiyonel kimyasal sinaps farklılaşma edinimi temel gelişim programları. Bu arayüz, soruşturma için son derece önemli bir alandır. Drosophila, fonksiyonel gelişimi bu aşamalarda son embriyogenez üçüncü sırasında <8 saatlik bir süre (25 ° C) sırasında oluşur. Bu geç gelişim döneminde uzun, sert, geçirimsiz epidermal manikür birikimine soruşturma nedeniyle dirençli kabul edildi. Bir atılım önceden yerel kontrollü geç evre embriyo diseksiyonu etkinleştirmek için manikür uygulanabilir, su polimerize cerrahi yapıştırıcı uygulama oldu. Dorsal longitudinal insizyon ile deneysel olarak incelenmesi için embriyonun ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kas açığa, düz belirtilen olabilir. Bu sistem, ağır embriyonik sinaps oluşumunu bozar ve dolayısıyla sinaps bağlantıları ve fonksiyonel sinaptik sinyalizasyon özellikleri şartname ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler mekanizmaları ortaya genetik mutantları ve karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Protocol

Bölüm 1: Ekipman ve Malzemeleri Iyi bir diseksiyon mikroskobu, embriyo diseksiyonları için gerekli olan; 40X büyütme 25X göz adet ile maksimum büyütme artırmak için önerilmektedir. Güzel forseps (sayı 5), embriyo ve embriyo devitellinization manuel seçimi için gereklidir. Ekipman ince cam iğne yapmak ve değiştirmek için gereklidir. Çekti cam iğneler diseksiyon için gereklidir. Diseksiyon (uzun ömürlü) için sağlam bir cam tercih, ama standart kalın duvarlı cam …

Discussion

Embriyo kesin evreleme nedeniyle fonksiyonel özellikleri, sadece birkaç saat zaman boyunca hızlı bir şekilde olgunlaşması için çok önemlidir. Çeşitli konularda bu evreleme zorlaştırıyor. İlk olarak, pek çok araştırmacı dönem embriyoların zaman yumurta bırakır, ancak yumurtlama zamanı farklı koşullar (Broadie ve ark 1992), hayvandan hayvana çok değişebilir. Özellikle kısıtlı bir diyet, kadın, uzun süre önce döşeme döllenmiş yumurta korumak eğilimindedir. Bu nedenle en az 2 gün ?…

Acknowledgements

KB NIH hibe GM54544 tarafından desteklenmektedir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Embryo Collection Cages   Genesee Scientific (www.flystuff.com) 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184   Dow Corning Available from various companies Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm   various   For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application   Tygon   Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. i. t. t. l. e. t. o. n., Broadie, K., MA, B. h. a. t., Harbecke, R., JA, L. e. n. g. y. e. l., Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. r. a. n. d. Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. , 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O’Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. e. o. n. a. r. d. o. a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux’s Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Martinez Arias, A. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. v. a. n. d. e., Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neurosciences. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3. r. d., Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP.. Genesis. 34, 142-145 (2002).
check_url/fr/1347?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347, doi:10.3791/1347 (2009).

View Video