Culturas primárias de<em> Aplysia</em> Sensório-motor neurônios fornecer uma preparação do modelo para o estudo da formação de sinapses e plasticidade sináptica<em> In vitro</em>. Este vídeo demonstra a identificação e microdissecção de neurônios sensoriais e motores de<em> Aplysia</em> Gânglios, bem como os métodos de estabelecimento e manutenção de sensório-motor neurônios em cultura.
O sistema nervoso dos moluscos marinhos Aplysia californica é relativamente simples, consistindo de aproximadamente 20.000 neurônios. Os neurônios são grandes (até 1 mm de diâmetro) e identificável, com tamanhos distintos, formas, posições e pigmentações, e os corpos celulares são externamente expostas em cinco gânglios emparelhados distribuídos por todo o corpo do animal. Estas propriedades têm permitido investigadores para delinear os circuitos subjacentes comportamentos específicos no animal 1. A conexão entre os neurônios monossináptico sensorial e motora é um componente central do reflexo de retirada gill-in do animal, um simples reflexo defensivo em que o animal retira a sua guelra em resposta à estimulação tátil do sifão. Este reflexo sofre as formas de aprendizagem não-associativa e associativa, incluindo a sensibilização, a habituação e condicionamento clássico. De especial interesse para o estudo da plasticidade sináptica, a sinapse sensório-motor pode ser reconstituída na cultura, onde bem caracterizados estímulos provocam as formas de plasticidade que correlaciona direta no comportamento do animal 2,3. Especificamente, a aplicação de serotonina produz um fortalecimento sináptico que, dependendo do protocolo de aplicação, tem a duração de minutos (curto prazo facilitação), horas (médio prazo facilitação) ou dias (longo prazo facilitação). Em contraste, a aplicação do FMRFamide peptídeo transmissor produz um enfraquecimento sináptica ou a depressão que, dependendo do protocolo de aplicação, pode durar de minutos a dias (depressão a longo prazo). O grande tamanho dos neurônios permite a gravação eletrodo repetido acentuada da força sináptica ao longo de períodos de dias, juntamente com microinjeção de vetores de expressão, siRNAs e outros compostos para alvo específico cascatas de sinalização e moléculas e, assim, identificar os passos molecular e celular biológicos que estão por trás das mudanças na eficácia sináptica.
Uma vantagem adicional do sistema de cultura Aplysia vem do fato de que os neurônios demonstrar sinapse especificidade na cultura 4,5. Assim, os neurônios sensoriais não formam sinapses com eles mesmos (autapses) ou com outros neurônios sensoriais, nem formam sinapses com não-alvo identificados neurônios motores em cultura. O varicosidades, sites de contato sinápticas entre os neurônios sensoriais e motores, são grandes o suficiente (2-7 mícrons de diâmetro) para permitir a formação de sinapses (bem como alterações na morfologia sináptica) com os neurônios motores alvo a ser estudado no nível de luz microscópica.
Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas sensório-motor neurônio, incluindo adultos e anestesiar Aplysia juvenil, dissecando seus gânglios, a digestão protease dos gânglios, a remoção do tecido conjuntivo por microdissecção, a identificação de ambos os neurônios sensoriais e motores e remoção de cada tipo de célula por microdissecção, chapeamento do neurônio motor, além do neurônio sensorial e manipulação da neurite sensorial para o formulário de contato com a cultura do neurônio motor.
O êxito da preparação Aplysia sensório-motor culturas tem uma curva de aprendizado um pouco lento, pois envolve o desenvolvimento de habilidades motoras finas associados com microdissecção e manipulação de neurônios individuais visualizada através de um estereomicroscópio. Em nossa experiência, que leva cerca de 1-3 semanas de prática para obter saudável isolado neurônios sensoriais na cultura e uma semana adicional 1-3 para aprender a par de neurônios sensoriais com os neurônios motores. Rotin…
Trabalho no laboratório envolvendo a cultura de neurônios Aplysia é financiado pelo NIH lista R01 e R21MH077921 NIH.
Solutions needed for culture
L-15 powder | 13.8g |
NaCl | 15.4 g |
D-Glucose | 6.24 g |
MgSO47H20 | 6.45g |
KCl | 350 mg |
NaHCO3 | 170 mg |
MgCl26H2O | 5.49 g |
CaCl22H2O | 1.43g |
HEPES | 3.53g |