הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית
Summary
תרבויות ראשונית של<em> Aplysia</em> חושית מוטורית נוירונים לספק הכנת מודל לחקר היווצרות הסינפסה ואת הפלסטיות הסינפטית<em> במבחנה</em>. וידאו זה מדגים את זיהוי microdissection של נוירונים החושי והמוטורי מ<em> Aplysia</em> הגרעינים, כמו גם את השיטות לקביעת ושמירה על חושית, מוטורית נוירונים בתרבית.
Abstract
מערכת העצבים של רכיכה ימית Aplysia californica היא פשוטה יחסית, בהיקף של כ -20,000 נוירונים. הנוירונים הם גדולים (עד 1 מ"מ קוטר) לזיהוי, עם גדלים, צורות שונות, עמדות pigmentations, ואת גופי התא נחשפים מבחוץ בגרעיני five לזווג מופץ בכל רחבי הגוף של החיה. תכונות אלו אפשרו לחוקרים לשרטט את המעגלים החשמליים הבסיסיים התנהגויות ספציפיות החיה 1. הקשר בין הנוירונים monosynaptic החושי והמוטורי היא מרכיב מרכזי של רפלקס הזימים-הנסיגה בשנת החיה, רפלקס הגנתי פשוט שבו החיה תיסוג הזימים שלו בתגובה לגירוי חוש המישוש של הסיפון. רפלקס זה עובר צורות של למידה בלתי אסוציאטיביים אסוציאטיבי, כולל רגישות, התרגלות ועל התניה קלאסית. תועלת מיוחדת ללימוד הפלסטיות הסינפטית, בסינפסה חושית מוטורית ניתן מחדש בתרבות, שם היטב מאופיין גירויים להפיק צורות פלסטיות כי יש מקבילות ישיר בהתנהגות של החיה 2,3. באופן ספציפי, יישום של סרוטונין מייצרת חיזוק הסינפטי, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, נמשך דקות (לטווח קצר סיוע), שעות (טווח ביניים סיוע) או ימים (לטווח ארוך סיוע). לעומת זאת, יישום FMRFamide את המשדר פפטיד מייצרת היחלשות דיכאון סינפטיים או, בהתאם לפרוטוקול הבקשה, יכול להימשך בין דקות יום (לטווח ארוך דיכאון). גודל גדול של נוירונים מאפשר הקלטה חזר אלקטרודה חדה של חוזק סינפטי על פני תקופות של ימים יחד עם microinjection של וקטורים הביטוי, siRNAs ותרכובות אחרות למקד מפלי איתות ספציפיים מולקולות ובכך לזהות את השלבים ביולוגי מולקולרית של התא העומדים בבסיס השינויים ביעילות סינפטית.
יתרון נוסף של מערכת התרבות Aplysia נובעת מהעובדה כי הנוירונים סינפסה להפגין-סגוליות בתרבות 4,5. לפיכך, עצב סנסורי לא יוצרים סינפסות עם עצמם (autapses) או עם עצב סנסורי אחרים, ואין הם יוצרים סינפסות עם יעד שאינו הנוירונים המנוע מזוהה בתרבות. ורידים, אתרים של הקשר הסינפטי בין הנוירונים החושי והמוטורי, הם גדולים מספיק (2-7 מיקרון בקוטר) כדי לאפשר היווצרות הסינפסה (כמו גם שינויים במורפולוגיה הסינפטי) עם הנוירונים המנוע היעד להיחקר ברמה המיקרוסקופית אור.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת חושית מוטורית תרבויות נוירון, כולל הרדמה מבוגר ו Aplysia נעורים, לנתח הגרעינים שלהם, העיכול פרוטאז של הגרעינים, הסרת רקמת החיבור ידי microdissection, זיהוי של שני נוירונים החושי והמוטורי והסרה של כל סוג תא ידי microdissection, ציפוי של הנוירון המוטורי, תוספת של הנוירון מניפולציה חושית של neurite החושי כדי ליצור קשר עם תרבות מוטורית נוירון.
Protocol
Discussion
הכנה מוצלחת של Aplysia חושית מוטורית תרבויות יש עקומת למידה איטי במקצת, שכן הוא כרוך בפיתוח המוטוריקה העדינה קשורה microdissection ומניפולציה של נוירונים בודדים נצפים מבעד למיקרוסקופ, סטריאו. מניסיוננו, זה לוקח כ 1-3 שבועות של תרגול כדי להשיג בריא עצב סנסורי בודד בתרבות 1-3 ש…
Acknowledgements
עבודה במעבדה מעורבים culturing של Aplysia נוירונים ממומנת על ידי רשימה NIH R01 ו-NIH R21MH077921.
Materials
Solutions needed for culture
- 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia.
- Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
- L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g - Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
- Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
- Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.
References
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Rayport, S. G., Schacher, S. Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization. J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).
- Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).
- Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro. Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).
- Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage. Cell. 91 (7), 927-938 (1997).
- Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure. Cell. 111 (4), 483-493 (2002).
