の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

Summary

の初代培養<em>アメフラシ</em>感覚運動ニューロンは、シナプス形成とシナプス可塑性を研究するためのモデルの準備をしなくては<em> in vitroで</em>。このビデオでは、より感覚および運動ニューロンの同定とマイクロダイセクションを示しています<em>アメフラシ</em>節と同様に文化の中で感覚運動ニューロンを確立し、維持するための方法。

Abstract

海洋軟体動物アメフラシカリの神経系は、約20,000のニューロンで構成される、比較的簡単です。ニューロンは、異なるサイズ、形状、位置や色素沈着で、大（直径最大1 mm）と識別可能であり、細胞体は、外部から動物の体全体に分散fiveペアの神経節に公開されています。これらのプロパティは、動物¹の特定の行動の根底に回路を描くために捜査官を許可している。感覚および運動ニューロン間のシナプス接続は、動物の鰓の離脱反射、動物は、サイフォンの触覚刺激に応答し、その鰓を撤回したシンプルな防衛反射の中心的なコンポーネントです。この反射は、感作、馴化と古典的条件を含む非結合と連合学習の形態を、受ける。シナプス可塑性の研究に特に有益である、感覚運動シナプスが十分に特徴付けられた刺激は動物^2,3の動作に直接の相関を持っている可塑性の形態を引き出す場所、文化の中で再構成することができる。具体的には、セロトニンのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの強化を生成する、（長期的なファシリテーション）分（短期促進）、時間（中間的なファシリテーション）または数日間続きます。対照的に、ペプチドトランスミッタFMRFamideのアプリケーションは、アプリケーションのプロトコルに応じて、シナプスの弱体化やうつ病を生成、日（長期不況）に数分から続くことができる。ニューロンの大サイズが特定のシグナル伝達カスケードと分子を標的とし、それによって変化の根底にある分子細胞生物学的なステップを識別するための発現ベクター、siRNAおよび他の化合物のマイクロインジェクションと一緒に日の期間にわたってシナプス強度の繰り返し鋭い電極の録音が可能シナプス伝達効率インチ

アメフラシの培養系のさらなる利点は、神経細胞が培養^4,5でシナプス-特異性を示すという事実に由来しています。このように、感覚ニューロンは、それ自体（autapses）でまたは他の感覚ニューロンとシナプスを形成しない、またかれらは、培養中の非標的同定された運動ニューロンとシナプスを形成してください。 varicosities、感覚および運動ニューロン間のシナプス接触部位は、光学顕微鏡レベルで検討する対象の運動ニューロンとのシナプス形成を（だけでなく、シナプスの形態変化）を許可する（直径2-6：ミクロン）に十分な大きさです。

このビデオでは、我々は彼らの神経節、神経節のプロテアーゼ消化、顕微解剖により結合組織の除去、感覚および運動ニューロンと除去の両方の識別を解剖、麻酔、成人および若年アメフラシを含む感覚運動ニューロンの培養を、準備の各ステップを示す顕微解剖によって各細胞型の、運動ニューロン、培養運動ニューロンとの接触を形成するために感覚神経の感覚神経や操作の追加のメッキ。

Protocol

準備（ソリューションの構成のためのプロトコルの終了時にソリューションを参照してください） 培養皿を準備します。ポリ- L -リジン（ホウ酸ナトリウムで作られた）とマテックガラス底培養皿のよくコートガラス。完全によくガラスをカバーし、> 1時間（一晩放置することができます）に向けて出発するのに十分な追加。徹底的に人工海水（ASW）4-5回ですすぐことにより、ポリ…

Discussion

それは、ステレオ顕微鏡を通して見た個々の神経細胞のマイクロダイセクションと操作に関連付けられている細かい運動能力の開発を含んでいるので、 アメフラシ感覚運動文化の成功の準備は、やや遅い学習曲線を持っています。我々の経験では、それは運動ニューロンと感覚ニューロンをペアリングする方法については、文化と追加の1〜3週間で健康な分離感覚神経を得るために練?…

Materials

Solutions needed for culture

1. 0.35 M MgCl₂, stored at room temperature, used for anesthesia.
2. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
3. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
   

   L-15 powder	13.8g
   NaCl	15.4 g
   D-Glucose	6.24 g
   MgSO4•7H20	6.45g
   KCl	350 mg
   NaHCO3	170 mg
   MgCl2•6H2O	5.49 g
   CaCl2•2H2O	1.43g
   HEPES	3.53g

   Add ddH20 to 1 liter.  The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.
4. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
5. Culture medium.  Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
6. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl₂(6H₂O), 20 mM MgSO₄, 10 mM CaCl₂(2H₂O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.