Summary
Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.
Abstract
Fatores de crescimento plaquetário derivados têm sido mostrados para estimular a proliferação celular de forma eficiente
Protocol
1. Material de partida
Comece com plaquetas plasma rico (PRP) unidades preparadas por Citaferese ou derivados de buffy casacos.
2. Verificar a esterilidade
Para verificar a esterilidade tirar uma amostra de 20 mL de cada unidade PRP, transferindo o volume para uma bolsa pequena conectado (Baxter). Desconecte este saco com solda.
3. Congelamento de unidades PRP
Imediatamente após a preparação, congelar as unidades PRP até pelo menos -20 ° C no saco de armazenamento original, sem manipulação posterior.
4. Descongelamento das unidades HPL
Quando os testes bacteriana são negativos, descongele humana unidades lisado de plaquetas, agora chamados de unidades HPL a 37 ° C (banho de água) até que os coágulos de gelo desaparecer. Não aqueça o HPL.
5. Agrupamento de unidades de HPL
Tome pelo menos 10-15 descongelado unidades HPL para um pool de plaquetas lisado para preparar um produto padronizado. Conectar os sacos HPL consecutivamente para o saco de pooling de casal (MacoPharma) e transferir o HPL nesses dois sacos. Desligue o sacos vazios HPL por soldadura. Obter um volume final de 3 a 4 L de pooled lisado de plaquetas humanas (pHPL), misturando o conteúdo dos dois sacos. Conectar um pequeno saco (Baxter) e tirar uma amostra de 20 mL para pHPL verificar a esterilidade do produto em pool. Desconecte este saco com solda.
6. Porcionamento do pHPL
PHPL a parte para obter alíquotas adequadas para processamento posterior. Conectar pequenos sacos (Baxter) para o saco de pooling de casal (Macopharma) e transferência de volumes de até 250 mL para os sacos de armazenamento pequeno (Baxter). Desconecte os sacos cheios de soldagem.
7. Re-congelamento das alíquotas pHPL
Aumentar a taxa de fragmentação de plaquetas e da quantidade de fatores de crescimento liberados por uma etapa de congelamento / descongelamento mais. Congelar os pequenos sacos de pHPL porções de novo, pelo menos, -20 ° C.
8. Re-descongelamento e porcionamento das alíquotas pHPL
Descongelar os sacos pHPL a 37 ° C (banho de água). Transferir o conteúdo em frascos de 50 ml (Falcons BD), cortando o tubo do saco com uma tesoura esterilizada e derramar o pHPL para os frascos. Realizar esta etapa em um banco de fluxo laminar para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica.
9. Remoção de fragmentos de plaquetas
Como fragmentos de plaquetas tendem a se agregar e pode induzir a aloimunização, removê-los do pHPL. Centrifugue os tubos pHPL, portanto, a 4.000 g (15 minutos, 4 ° C). Em uma pipeta bancada de fluxo laminar o plasma sobrenadante para os frascos de armazenamento final (Falcons BD) e descartar as pelotas de plaquetas para evitar fragmentos em cultura de células.
10. Armazenamento de pHPL
Congelar alíquotas de 50 mL pHPL novamente em menos 20 ° C e armazená-los para uso experimental.
11. Uso de pHPL em cultura de células
Inicialmente adicionar heparina sem conservantes para o meio para evitar a formação de gel. Descongelar uma alíquota pHPL a 37 ° C e completar o meio de cultura pela adição de 8-10%.
Médiuns
MSC Médio:
Use 500 mL de uma MEM, adicione 56 ml de pHPL descongelados (ver também referência 1 para mais detalhes) e 2 UI / mL (= 224 ml de solução-estoque) de heparina sem conservantes (evita a coagulação do meio através do acúmulo de o fibrinogênio no plasma) para alcançar uma concentração final de pHPL 10%. Além disso adicionar penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100μg/mL) e solução de 2mM de L-glutamina (ambos Sigma).
Filtrar o meio através do filtro a vácuo a 20 mM de poros tamanho (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).
ECFC-Medium:
Use uma garrafa (500 ml) de EBM, adicionar as alíquotas de citocinas, 56 mL de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl da solução de reserva) de conservante livre de Heparina, Penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100 g / mL de solução) e 2mM de L-glutamina ao meio basal e com um filtro de 20 l de poros tamanho vácuo filtro (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).
Figura 1: Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de uma doação de sangue total de um banco de sangue local ou qualquer outro fornecedor autorizado. Após a centrifugação do sangue pode ser separado em plasma, buffy coat e células vermelhas do sangue. Quatro unidades de buffy coat, o grupo sanguíneo O e um grupo sanguíneo AB plasma podem ser combinadas antes da centrifugação para separar o plasma rico em plaquetas. A regularidade de qualidade unidade de plasma rico em plaquetas de aproximadamente 300mL deve conter 1x10 9 plaquetas por ml ou 11 3x10 plateletotal de ts.
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Discussion
Em algumas regiões de plaquetas plasma rico (PRP) podem ser obtidas buffy-coats de outra forma de ser um produto embalado resíduos de produção de glóbulos vermelhos a partir de doações de sangue testadas (Figura 1). Idealmente, PRP é usado imediatamente para melhor preparação de pHPL, como em plaquetas desatualizado concentra a disponibilidade de fatores de crescimento pode ser reduzido devido a lesões de armazenamento de plaquetas e degradação 20. Recomenda-se ainda para produzir PRP combinando as plaquetas de sangue do grupo O com plasma de sangue grupo AB, para evitar possíveis influências dos antígenos ABH e isoagglutinins. Até agora, culturas de células têm usado principalmente soro fetal bovino (FBS), que assume o risco de xenoimmunization 21 e transmissão de patógenos conhecidos e desconhecidos. Alternativas, tais como media soro autólogo ou soro livre de ainda não conseguir substituir FBS em muitas aplicações. 22 Em estudos anteriores têm comparado os efeitos da pHPL FBS e na expansão de células mesenquimais estromais revelando uma maior eficiência na propagação de pHPL celular. 7,8,23 A expansão do isolamento e em grande escala de células progenitoras endoteliais em animais sem soro condições em EGM-2 suplementado com pHPL tem sido demonstrado por Reinisch et. al. 11 e é ainda apresentado como um protocolo JOVE por Nicole A. Hofmann. Os protocolos para a elaboração MSC e preparações médio ECFC são descritos nas figuras 2 e 3.
O uso de pHPL como um substituto potente para FBS representa um passo em direção a um atraente animais Práticas de Fabricação sem soro (BPF) compatível com o desenvolvimento de células terapêuticas para aplicação clínica. 9,24
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Acknowledgments
Este trabalho tem sido apoiada pelo austríaco Research Foundation (FWF, conceder N211-NAN para DS) ea Agência de Promoção Austrian Research (FFG, conceder N200 para DS). Os autores agradecem a Claudia Url para assistência técnica excelente e Farrell Monica para a edição de linguística.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | |
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | |
| Plasma bags (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterile tubing welder | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Water bath | |||
| Sterile scissors | |||
| Clamps | |||
| Centrifuge |
References
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P.
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).
