Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen
Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie Spannungs-sensitiven Farbstoffen optische Erfassung der elektrischen Aktivität ermöglichen aus intakten neuronalen Netzen wie dem Plexus des Meerschweinchens enterale Nervensystem, mit einer einstellbaren Auflösung reicht von Einzel-Zellen zu multi-ganglionären Schaltung.
Abstract
Die enterale Nervensystem (ENS) ist ein in sich geschlossenes Netzwerk mit identifizierten Funktionen, ausführen kann komplexe Verhaltensweisen in Isolation. Seine Neuronen (10 bis 25 &mgr; m Durchmesser) sind in Geflechten, die verschiedene Ebenen der Darmwand beschränkt sind so angeordnet<sup> 1</sup>, Der Plexus myentericus zwischen den Längs-und Ringmuskel Schichten, und die submuköse Plexus zwischen der Ringmuskelschicht und der Schleimhaut zu finden. Da der Effektor-Systeme für diese Geflechte (Transport Epithel, endokrine Zellen immun-Elemente, die Blutgefäße und der glatten Muskulatur) auch innerhalb der Darmwand enthalten sind, können semi-intakten Präparationen seziert, die Erhaltung einzelner Komponenten verschiedener Reflexbahnen werden. Das Verhalten der Effektor-Systeme wird durch die submuköse und myentericus Geflechte, die gemeinsam handeln. Daher ist die genaue Kenntnis der synaptischen Interaktion innerhalb und zwischen den Ganglien und der Kommunikation zwischen den Geflechten, essentiell für das Verständnis normaler Magen-Darm-Funktion. Die ENS, wie ein intaktes Nervensystem, ist ein einzigartiges experimentelles Modell, in dem man molekularen und zellulären Vorgänge mit dem elektrischen Verhalten des neuronalen Netzes und seiner physiologischen Ausgänge können zu korrelieren. Aufgrund der quasi-zweidimensionale Organisation der Plexus ist die ENS besonders gut für die Untersuchung von neuronalen Netzen mit mehreren Standorten optischen Aufnahmetechniken, die spannungsabhängigen Farbstoffen beschäftigen geeignet<sup> 2,7,8,9</sup>. Wir werden hier erläutern die Verwendung eines relativ neuen naphthylstyryl-pyridinium Farbstoff (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> Das bietet mehrere Vorteile gegenüber seinen Vorgängern, darunter sehr niedrig Phototoxizität, langsame Verinnerlichung und bemerkenswerte chemische Stabilität. In Verbindung mit einer Kamera, die sub-Millisekunden-Auflösung ermöglicht verwendet wird, ermöglicht dieser Farbstoff uns auf die elektrische Aktivität aller Nervenzellen in das Blickfeld mit einer maximalen Auflösung von ~ 2,5 um bei 100-facher Vergrößerung zu überwachen. Bei geringer Vergrößerung (10X oder 20X), ist das Opfer der Single-Cell-Auflösung durch einen Gewinn in Sicht ausgeglichen und enthüllt die Feinheiten der inter-ganglionären Schaltung.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll wurde mit zwei Toren im Hinterkopf geschrieben worden. Die erste besteht darin, andere Forscher zu überzeugen, dass, dank der vielen technologischen Fortschritte des letzten Jahrzehnts, optische Erfassung der elektrischen Aktivität mit spannungsabhängigen Farbstoffen hat sich zu einem der mächtigsten, zuverlässige und erschwingliche Methoden zur Untersuchung von intakten neuronalen Netzen, ja , könnte es leicht implementiert sogar in einem Labor mit bescheidenen Mitteln. Das zweite Ziel ist es, di…
Acknowledgements
Wir möchten DA Coulter (CHOP) für die Erlaubnis, seine 2-Photonen-Mikroskop verwenden, um die 2-Photonen-Bilder am Anfang des Videos gezeigt, und H. Takano für den Austausch mit uns sein technisches Know-how erwerben, zu danken.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
References
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
