Visualisatie van<em> In vivo</em> RNA transport wordt gerealiseerd door micro-injectie van fluorescent gelabelde RNA transcripten in<em> Xenopus</em> Eicellen, gevolgd door confocale microscopie.
RNA lokalisatie is een geconserveerd mechanisme van oprichting van celpolariteit. VG1 mRNA lokaliseert aan de plantaardige pool van Xenopus laevis oöcyten en handelt om ruimtelijk te beperken genexpressie van VG1 eiwit. Strikte controle van de VG1 distributie op deze manier is vereist voor een goede kiemlaag specificatie in de zich ontwikkelende embryo. RNA sequentie elementen in de 3 'UTR van het mRNA, de VG1 lokalisatie element (VLE) zijn vereist en voldoende zijn om rechtstreeks vervoer. De studie van de erkenning en het transport van VG1 mRNA in vivo, hebben we een beeldvormende techniek die een uitgebreide analyse van de trans-factor gericht transport mechanismen kan via een eenvoudige visuele uitlezing.
Te visualiseren RNA lokalisatie, we synthetiseren fluorescent gelabelde VLE RNA en microinject dit transcript in individuele eicellen. Na een eicel cultuur om het vervoer van de geïnjecteerde RNA toe te staan, eicellen staan vast en uitgedroogd voorafgaand aan de beeldvorming door confocale microscopie. Visualisatie van mRNA lokalisatie patronen biedt een uitlezing voor het toezicht op de volledige route van RNA transport en voor het identificeren van rollen in regie RNA vervoer voor cis-werkende elementen binnen de transcriptie en trans-werkende factoren die binden aan de ELO (Lewis et al.., 2008, Messitt et al.., 2008). We hebben uitgebreid deze techniek door middel van co-localisatie met extra RNA en eiwitten (Gagnon en Mowry, 2009, Messitt et al.., 2008), en in combinatie met verstoring van motorische eiwitten en het cytoskelet (Messitt et al., 2008). Te probe mechanismen ten grondslag liggen mRNA lokalisatie.
Hier hebben we voorgesteld een protocol voor het visualiseren van mRNA lokalisatie in Xenopus oöcyten. Deze methode, met behulp van fluorescent gelabelde RNA-transcripten heeft een hogere signaal-ruisverhouding dan voorheen verkregen met digoxigenine-gelabeld transcripties en is eenvoudiger en sneller dan in-situ gebaseerde benaderingen (Mowry en Melton, 1992, Gautreau et al.., 1997). Met deze methode kunnen we engineer RNA-sequentie mutaties en snel te testen voor in vivo-functie. Verder, door gebrui…
The authors have nothing to disclose.
Ons werk op lokalisatie RNA wordt ondersteund door een subsidie van de NIH (R01GM071049) naar KLM.
10X Tx buffer
20x cap/NTP mix
G-50 column
Collagenase solution
MBSH buffer
Oocyte Culture Medium
MEMFA solution
Computing RNA yield