Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Summary

Görselleştirme<em> In vivo</em> RNA ulaşım floresan etiketli RNA transkript mikroenjeksiyon yapılır<em> Xenopus</em> Oosit, konfokal mikroskobu ile takip.

Abstract

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 'UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler.

RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Protocol

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon. Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir. 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin: a. 10X Tx tampon (M & M) 2 ul b. 20X kapak /…

Discussion

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, …

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.