可视化的RNA中的本地化爪蟾卵母细胞

Summary

可视化<em>在体内</em> RNA的运输是通过微量注射荧光标记的RNA转录成<em>爪蟾</em>卵母细胞，共聚焦显微镜。

Abstract

RNA本地化是一个保守的机制，建立细胞极性。 VG1基因定位于非洲爪蟾卵母细胞和行为空间限制VG1蛋白基因表达的植物极。 VG1分布严格控制，这种方式是需要适当的生殖发育中的胚胎层规范。 RNA序列的mRNA的3'UTR区的元素，VG1本地化元素（VLE）是必要的和足够的直接运输。要研究的认可和VG1基因在体内的运输，我们已开发出一种成像技术，可以通过一个简单的视觉读数跨因素的传输机制进行了广泛分析。

为了形象化RNA的本地化，我们合成荧光标记的VLE的RNA和microinject到个人的卵母细胞成绩单。后卵母细胞培养，让注入的RNA运输，卵母细胞共聚焦显微镜成像前固定和脱水。 mRNA的本土化模式的可视化提供了一个监测完整的RNA运输途径，并确定独联体范围内行事的成绩单和反式作用因子结合VLE（刘易斯等人，2008年的元素，在指导RNA的运输角色的读数Messitt等，2008）。我们已经扩展这种技术通过共同本地化与其他RNA和蛋白质（加尼翁和Mowry，2009年，Messitt等，2008），并结合马达蛋白和细胞骨架的破坏等，2008）（Messitt探测mRNA的本地化的内在机制，。

Protocol

第1部分：荧光标记基因的转录。 含有RNA的本地化元素或其他相关序列的质粒DNA线性化和重悬在1μg/μL的DEPC处理过的H 2 O DNA模板必须有T7，SP6，T3 RNA聚合酶转录上游启动网站。 无菌1.5ml离心管加入下列试剂： A. 10X Tx缓冲区（见M＆M的） 2μL B. 20X帽/ NTP的组合（见M＆M的） 1μL C. 1毫米的Alexa Fluor 546 – 14 – UTP（Invitrogen公?…

Discussion

在这里，我们提出了一个可视化mRNA 的爪蟾卵母细胞的本地化的协议。这种方法，使用荧光标记的RNA转录，具有较高的信噪比比以前取得与地高辛标记的成绩单和比在原位（Mowry和麦尔登，1992年，Gautreau等，1997）为基础的方法更简单，速度更快。使用这种方法，我们可以设计RNA序列突变，并迅速在体内的功能测试。此外，通过使用额外的Alexa的双绞线荧光团，多个RNA的物种可以被可视…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.