Visualizing शाही सेना स्थानीयकरण में Xenopus Oocytes
Summary
के विज़ुअलाइज़ेशन<em> Vivo में</em> शाही सेना के परिवहन के लिए fluorescently लेबल शाही सेना टेप के microinjection द्वारा पूरा किया है में<em> Xenopus</em> Oocytes, confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया.
Abstract
शाही सेना स्थानीयकरण सेल polarity की स्थापना के एक संरक्षित तंत्र है. Vg1 mRNA Xenopus laevis oocytes और spatially Vg1 प्रोटीन के जीन की अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए कार्य करता है की वनस्पति पोल localizes है. इस तरीके में Vg1 वितरण के चुस्त नियंत्रण विकासशील भ्रूण में उचित रोगाणु परत विनिर्देशन के लिए आवश्यक है. 3 'mRNA की UTR में शाही सेना अनुक्रम तत्वों, Vg1 स्थानीयकरण तत्व (VLE) की आवश्यकता है और सीधे परिवहन के लिए पर्याप्त हैं. और vivo में Vg1 mRNA की मान्यता परिवहन अध्ययन करने के लिए, हम एक इमेजिंग तकनीक है कि एक साधारण दृश्य readout के माध्यम से पार कारक निर्देशित परिवहन तंत्र के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है विकसित किया है.
शाही सेना स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए, हम fluorescently लेबल VLE शाही सेना synthesize और व्यक्तिगत oocytes में इस प्रतिलेख microinject. Oocyte संस्कृति के बाद इंजेक्शन शाही सेना के परिवहन की अनुमति के लिए, oocytes तय की और निर्जलित पूर्व confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए कर रहे हैं. विज़ुअलाइज़ेशन mRNA स्थानीयकरण पैटर्न की शाही सेना के परिवहन की पूरी मार्ग की निगरानी के लिए और सीआईएस प्रतिलेख और ट्रांस अभिनय कारक है कि VLE (लुईस एट अल., 2008 के लिए बाध्य भीतर तत्वों अभिनय के लिए शाही सेना परिवहन निर्देशन में भूमिकाओं की पहचान के लिए एक readout प्रदान करता है Messitt एट अल, 2008). हम सह स्थानीयकरण के माध्यम से इस तकनीक बढ़ाया है अतिरिक्त RNAs और प्रोटीन (Gagnon और Mowry, 2009, Messitt एट अल., 2008) के साथ, और मोटर प्रोटीन के विघटन और cytoskeleton के साथ संयोजन में (Messitt एट अल, 2008) की जांच करने के लिए mRNA स्थानीयकरण अंतर्निहित तंत्र.
Protocol
Discussion
यहाँ हम Xenopus oocytes में mRNA स्थानीयकरण दृश्यमान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इस विधि, fluorescently लेबल शाही सेना टेप का उपयोग उच्च संकेत से शोर अनुपात करने के लिए पहले digoxigenin लेबल टेप के साथ प्राप्त की ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
शाही सेना स्थानीयकरण पर हमारा काम KLM के लिए एनआईएच (R01GM071049) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
10X Tx buffer
- 60 mM MgCl2
- 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
- 20 mM spermidine-HCl
20x cap/NTP mix
- 10 mM CTP
- 10 mM ATP
- 9 mM UTP
- 2 mM GTP
- 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)
G-50 column
- Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
- 0.5 ml 0.2 M EDTA
- 1 ml 1 M Tris pH 8.0
- 0.5 ml 20% SDS
- Store complete G-50 solution at 4° C.
- Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
- Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
- Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
- Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
- Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin.
- Repeat wash twice more for a total of three washes.
- Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.
Collagenase solution
- 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
- 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)
MBSH buffer
- 88 mM NaCl
- 1 mM KCl
- 2.4 mM NaHCO3
- 0.82 mM MgSO4 X 7H2O
- 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O
- 0.41 mM CaCl2 X 6H2O
- 10 mM HEPES (pH 7.6)
Oocyte Culture Medium
- 50% L15 medium
- 15 mM HEPES (pH 7.6)
- 1 mg/ml insulin
- 100 mg/ml gentamicin
- 50 U/ml nystatin
- 50 U/ml penicillin
- 50 mg/ml streptomycin
MEMFA solution
- 0.1 M MOPS (pH 7.4)
- 2 mM EGTA
- 1 mM MgSO4
- 3.7% formaldehyde
Computing RNA yield
- Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
- incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
- Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
- Maximum theoretical yields for different polymerases:
T7, T3, SP6 – 2.64 μg - Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
- Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8)
- The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.
References
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