Visualizzazione di<em> In vivo</em> RNA di trasporto si ottiene microiniezione di fluorescente trascrizioni di RNA in<em> Xenopus</em> Ovociti, seguito dalla microscopia confocale.
Localizzazione dell'RNA è un meccanismo conservato di stabilire la polarità delle cellule. Vg1 mRNA localizza al polo vegetale ovociti di Xenopus laevis e atti a limitare spazialmente l'espressione genica di VG1 proteine. Stretto controllo VG1 distribuzione in questo modo è richiesto per l'indicazione corretta foglietto embrionale di un embrione in via di sviluppo. Elementi di sequenza di RNA nel 3 'UTR del mRNA, il VG1 elemento di localizzazione (VLE) sono necessari e sufficienti per trasporto diretto. Per studiare il riconoscimento e il trasporto del VG1 mRNA in vivo, abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che permette un'analisi approfondita dei trans-fattore di meccanismi di trasporto diretto attraverso una semplice lettura visiva.
Per visualizzare la localizzazione di RNA, che sintetizzano fluorescente RNA VLE e microinject questa trascrizione in ovociti individuali. Dopo la cultura degli ovociti per consentire il trasporto del RNA iniettato, gli ovociti vengono fissate e disidratate prima di imaging, microscopia confocale. Visualizzazione di modelli di localizzazione mRNA fornisce una lettura per il monitoraggio del percorso completo di RNA di trasporto e per l'individuazione dei ruoli nel dirigere l'RNA di trasporto per cis-acting elementi all'interno della trascrizione e trans-acting fattori che si legano al VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Abbiamo esteso questa tecnica attraverso la co-localizzazione di RNA e proteine addizionali (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e in combinazione con la rottura del motore e di proteine del citoscheletro (Messitt et al., 2008) di sondare meccanismi alla base di localizzazione mRNA.
Qui abbiamo presentato un protocollo per visualizzare la localizzazione mRNA in ovociti di Xenopus. Questo metodo, utilizzando fluorescente trascrizioni di RNA è più alto rapporto segnale-rumore di quanto precedentemente ottenuti con marcati con digossigenina trascrizioni ed è più semplice e più veloce di approcci basati in situ (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Utilizzando questo metodo, possiamo progettare mutazioni sequenza di RNA e rapidamente test per funzione in vivo. Inoltre, u…
The authors have nothing to disclose.
Il nostro lavoro sulla localizzazione di RNA è supportata da una sovvenzione da parte del NIH (R01GM071049) a KLM.
10X Tx buffer
20x cap/NTP mix
G-50 column
Collagenase solution
MBSH buffer
Oocyte Culture Medium
MEMFA solution
Computing RNA yield