Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

Summary

La visualización de<em> In vivo</em> ARN de transporte se realiza mediante la microinyección de la etiqueta fluorescente en las transcripciones de ARN<em> Xenopus</em> Ovocitos, seguido por microscopía confocal.

Abstract

Localización del ARN es un mecanismo conservado del establecimiento de la polaridad celular. Vg1 ARNm se localiza en el polo vegetal de ovocitos de Xenopus laevis y actúa para restringir el espacio de expresión génica de la proteína Vg1. El control estricto de Vg1 distribución de esta forma es necesaria para la especificación adecuada capa germinal en el embrión en desarrollo. Elementos de la secuencia de ARN en el 3 'UTR del ARNm, el elemento de localización Vg1 (VLE) son necesarios y suficientes para el transporte directo. Para estudiar el reconocimiento y el transporte de Vg1 ARNm in vivo, hemos desarrollado una técnica que permite un amplio análisis de trans-factor de los mecanismos de transporte dirigido a través de una lectura visual simple.

Para visualizar la localización del ARN, que sintetiza la etiqueta fluorescente del ARN VLE y microinject esta transcripción en oocitos individual. Después del cultivo de ovocitos para permitir el transporte del ARN se inyecta, los ovocitos son fijos y deshidratado antes de la imagen por microscopía confocal. Visualización de patrones de localización del ARNm proporciona una lectura para el control de la vía completa de ARN de transporte y para la identificación de los roles en la dirección de ARN de transporte para el cis-elementos que actúan en la transcripción y factores de trans-acción que se unen a los VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Hemos ampliado esta técnica a través de co-localización con ARN y las proteínas adicionales (Gagnon y Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), y en combinación con la interrupción de las proteínas motoras y el citoesqueleto (Messitt et al., 2008) de la sonda de mecanismos que subyacen a la localización del ARNm.

Protocol

Parte 1: La transcripción de ARNm marcado con fluorescencia. Linealizar el plásmido de ADN que contiene el elemento de localización del ARN o la secuencia pertinente y resuspender en 1 mg / l con DEPC tratados con H 2 O. La plantilla de ADN debe tener sitios aguas arriba promotor de la transcripción T7, SP6, T3 o ARN polimerasa. Añadir los siguientes reactivos a un tubo de 1,5 ml estéril: a. 10X buffer Tx (ver M & M) 2 l b. 20X…

Discussion

Aquí hemos presentado un protocolo para visualizar la localización del mRNA en ovocitos de Xenopus. Este método, usando la etiqueta fluorescente transcripciones de ARN tiene una mayor relación señal-ruido de lo que se obtiene con la marcada con digoxigenina transcripciones y es más sencillo y más rápido de lo in-situ los enfoques basados ​​en (Mowry y Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos diseñar ARN secuencia de mutaciones y rápida prueba para la función in …

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.