エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス
Summary
我々は、分化段階の遺伝子から潜在的なエンハンサー要素を発見し、モザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシスを通じてその機能を評価するために我々のアプローチを示しています。
Abstract
ヒトゲノム配列の完成は、他の多くの種のそれとともに、非コード配列に特定の機能をascribingの課題を浮き彫りにしました。ゲノムの非コード化割合で実施つの著名な機能は、遺伝子の転写を調節することですが、広く主要なDNA配列からのシス調節エレメントを予測する有効な方法はありません。我々は機能的にはゼブラフィッシュの遺伝子導入を通じて、潜在的なシス調節エレメントを評価するための効率的なプロトコルを開発した。それは空間的、時間的な遺伝子調節に関する情報を提供するため、我々のアプローチは、発達の重要な遺伝子の細胞培養ベースの技術上の重要な利点があります。逆に、それはより速く、より安価なトランスジェニックマウスで同様の実験よりも、我々は日常的に人間のゲノムから単離されたシーケンスに適用します。ここでは、クローニングシーケンスのシーケンスの保全と我々のプロトコルに基づいており、ゼブラフィッシュ胚にそれらをマイクロインジェクションをテストするための要素を選択するために我々のアプローチを示しています。
Protocol
Discussion
我々は、ゼブラフィッシュ遺伝子組み換えを使用して潜在的なエンハンサーの効率的な分析のために我々の研究室で使用されるアプローチを示している。ほとんどの場合、我々は、ヒト遺伝子に関連付けられている組織特異的エンハンサーを探すためにこのアプローチを使用してください。人間と魚の非コード配列との間の時間の最も明白な配列相同性の欠如にもかかわらず、我々はこのア?…
Acknowledgements
我々はpDB600プラスミドの種類のプレゼントのために優れた魚の飼育用さんポーラロイ、そしてスティーブEkkerさんに感謝。これらの研究は、NHGRIからSFへの助成金によって賄われた。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
