Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer
Summary
Nós demonstramos a nossa abordagem para encontrar elementos potenciais potenciador de genes regulados developmentally e avaliar a sua função através de transgênese zebrafish mosaico.
Abstract
A conclusão da seqüência do genoma humano, juntamente com a de muitas outras espécies, destacou o desafio de atribuir função específica a não seqüências de codificação. Uma função de destaque realizadas pela fração não-codificante do genoma é regular a transcrição de genes, no entanto, não existem métodos eficazes para prever amplamente cis-regulatórias elementos de seqüência de DNA primária. Nós desenvolvemos um protocolo eficiente para avaliar o potencial funcional cis-regulatórias elementos através de transgênese zebrafish. Nossa abordagem oferece vantagens significativas sobre cultura de células-técnicas baseadas em genes developmentally importante, pois fornece informações sobre regulação do gene espacial e temporal. Por outro lado, é mais rápido e menos dispendioso do que experimentos semelhantes em camundongos transgênicos, e nós rotineiramente aplicá-la a seqüências isoladas do genoma humano. Aqui demonstramos nossa abordagem para selecionar elementos para o teste com base na conservação de seqüência e nosso protocolo para seqüências de clonagem e microinjecting-los em embriões de peixe-zebra.
Protocol
Discussion
Nós demonstramos a abordagem utilizada em nosso laboratório para a análise eficiente de enhancers potencial usando transgênese zebrafish. Na maioria das vezes, usamos esta abordagem de olhar para o tecido-específicas enhancers associados com os genes humanos. Apesar da falta de homologia de seqüência mais óbvia do tempo entre humanos e peixes sequências não codificantes, descobrimos que esta abordagem é geralmente bem sucedido em identificar potenciadores para os genes de interesse para nós. Os fatores crít…
Acknowledgements
Agradecemos a Sra. Paula Roy para criação de peixe excelente, e Steve Ekker para o presente amável do plasmídeo pDB600. Estes estudos foram financiados por uma doação para SF de NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
