Summary
Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben
Abstract
Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine an ihre spezifischen Läsionen
Protocol
Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie
1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden.
- Für einige B. subtilis-Stämme (insbesondere Stämme, die schlecht wachsen, durch die Integration der translationale Fusion zwischen dem Gen von Interesse und GFP in seiner endogenen Locus), anfängliche Wachstum für zwei Tage vor der Bildgebung ist notwendig für qualitativ hochwertige Bilder. Am ersten Tag, Streifen der B. subtilis-Stamm, auf LB-Agar mit selektiven Antibiotikum (s) abgebildet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am zweiten Tag, impfen 100 ul von 0,85% Kochsalzlösung mit einer einzelnen Kolonie, und führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten (mit selektiven Antibiotika), Plattieren 100 ul jeder Verdünnung durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Am dritten Tag, wählen Sie die Verdünnung Platte mit Licht konfluenten Wachstum der Zellen. Licht konfluenten Wachstum auf einer Platte wird das Nährmedium mit einer gesunden, exponentiell wachsenden Starter Inokulum potenziell ergeben exzellente Bildergebnisse (siehe Schritt 4) liefern. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die höchste Qualität Membran-Bildgebung mit der Fleck FM4-64.
- Andere B. subtilis-Stämmen kann einfach auf selektive LB-Agar-Medium für einzelne Kolonien mit einer sterilen Stick am Tag vor der Bildgebung angewendet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am folgenden Tag werden die Zellen auf dieser Platte ausreichend sein, um als Inokulum für die Bildgebung zu verwenden (siehe Schritt 4).
HINWEIS: B. subtilis, werden über Nacht Kulturen in flüssigem Medium nicht angemessen auf eine Kombination der Sporenbildung und die Beschlussfähigkeit Antworten, die über einen längeren Zeitraum Lag-Phase Wachstum 1 führen wird.
2. Am Morgen des Imaging, 10 ml S7 50 3.1 Medium in einem 125 ml sterilen Erlenmeyerkolben.
3. Resuspendieren der Zellen in bis zu 2 mL der S7 50 mittelgroßen aus dem LB-Agar-Platte mit einzelnen Kolonien oder das Licht konfluenten Zellen zu einem Inokulum erhalten.
4. Fügen Sie genug S7 50 mittelgroßen Zelle Inokulum auf die Erlenmeyerkolben mit 10 mL S7 50 mittelgroßen für eine Kultur mit einer anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD 600) von ~ 0,08 bis 0,1. Bei diesem Schritt ist es wichtig, mindestens eine 10-fache Luft bis mittlere Verhältnis haben. So verwenden wir 10 bis 12,5 ml beimpft Medium in einem 125 mL Erlenmeyerkolben.
5. Wachsen jeder Kultur bei 30 ° C bis die Kultur eine OD 600 erreicht ~ 0,5-0,8. Schüttelwasserbäder mit Umdrehungen pro Minute 150 bis 200 bevorzugt. Kulturen mit DNA-schädigenden oder mismatch induzierende Mittel herausgefordert sollten in einem frühen exponentiellen Wachstumsphase werden OD 600, so dass die Zellen das Ziel zu erreichen OD 600 mit der zusätzlichen Zeit des Wachstums, die für die Behandlung erforderlich ist (siehe Tabelle 1)
Zum Beispiel erfordert 2-Amino einer Stunde Behandlung und damit eine Kultur mit 2-Amino behandelt werden, sollten bei OD 600 ~ 0,3-0,4 werden, so dass die eine Stunde Behandlung / Wachstum führt zu einer OD 600 ~ 0,5-0,8, wobei Zellen sind bereit für die Bildgebung.
Probenvorbereitung
1. Pipette 300 pl kultivierten Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß.
2. Wenn Bildgebung von Zell-Membranen gewünscht wird, fügen 1:1000 Verdünnung von FM4-64 Membran-Färbung (Invitrogen) zu jeder Probe aus einer 1 mg / ml Stammlösung. Eine Titration von FM4-64 erforderlich, um die gewünschte Fluoreszenz-Signal zu erzielen. Ein typisches Titration Bereich liegt bei 1:100, 1:1000 und 1:10.000.
3. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur für bis zu 10 Minuten oder zu sitzen, während die Folie wird mit 1% Agarose in 1X Spizizens Medium hergestellt, wie unten beschrieben (siehe Schritt 1 unter "Präparat").
4. Wenn die Konzentration der Zellen erforderlich ist, bevorzugen wir Filterung Zellen unter Verwendung eines 0,2 um-Filter mit einer Vakuumapparatur. Die Zellen können dann leicht von der Oberfläche des Filters mit PBS, eine andere geeignete Puffer oder Medium vor Visualisierung gewaschen werden.
Slide Vorbereitung
1. Bereiten Sie 1% Agarose mit 1X Spizizens.
5 ml 10X Spizizens Lager bis 45 ml ddH2O zusammen mit 0,5 g Agarose und Mikrowelle zu schmelzen. Hot geschmolzene Agarose ist schwierig, Pipette, und erstarrte Agarose wird nicht in die Pipettenspitze. Die Agarose sollte in einem Wasserbad äquilibriert auf eine Temperatur von ~ 55-65 ° C für sie die Pipettenspitze geben, ohne Verfestigung in der tip.
2. Draw 20 ul Spizizens mit 1% geschmolzener Agarose in die Pipettenspitze. Pipette einen Tropfen (etwa 1-2 ul) der Agarose-Lösung in jede Folie gut (wir benutzen 15-gut gleitet, siehe Tabelle 2) zu seicht Agarose Pads bilden. Die Agarose wird sofort erstarren. Folien müssen auch unmittelbar vor der Applikation der Zellen sein. Wenn die Agarose Pads bei Raumtemperatur allein gelassen werden, können sie innerhalb weniger Minuten austrocknen und unbrauchbar werden.
Agarose-Pads sollten zentriert und füllen jedes Loch aber minimale Höhe zu verhindern, dass das Deckglas, wenn Tröpfchen sind zu hoch (bubble-like) oder wenn die Probe breitet sich über die gut Grenze, einfach streichen die auch sauber und mit einer Kimwipe und anwenden neue Agarose-Pad.
3. Übernehmen Sie die gesamte 300 ul Probe (siehe Schritt 6), um die Folie, auf der Oberseite jeder Agarose Pad verteilt. Diese Menge an Zellen sollte ausreichen, um jedes Loch auf der Folie abdecken.
4. Lassen Sie die Folie mit Zellen geladen werden, um bei Raumtemperatur stehen lassen (23 ° C) für etwa 10 Minuten. Dieser Schritt wird für die Zellen auf dem Agarose-Pad zu unbeweglich und bereit für die Bildgebung niederlassen können. Für spezielle Bedürfnisse dieser Temperatur müssen möglicherweise geändert werden, zum Beispiel werden bei der Durchführung von Experimenten, die einen Temperatur-Shift 4 erfordern.
5. Absaugen entfernt das überschüssige Medium aus jeder Vertiefung, ohne die Pads selber.
6. Wenden Sie das Deckglas auf die Folie, Pressen fest und gleichmäßig, aber vorsichtig, über den Bereich der Folie. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas vor dem Schlitten und dass das Deckglas ist nicht über die Folie angehoben wird.
Visualisierung von Zellen
1. Viele verschiedene Fluoreszenz-Mikroskopen wird gut funktionieren. Es ist wichtig, zu einem 100X Ölimmersion haben. Die Simmons Lab verwendet:
- Olympus BX61 Mikroskop mit 1,45 NA TIRFM 100X Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD gekühlte Kamera
- Lumen 200 Bogen Metall (Vor-) Lichtquelle.
- Für die Detektion von GFP (FITC), Filter Anregung 460-500 und 510-560 Emission
- Für den Nachweis von FM4-64 (TRITC), Filter Anregung 510-560 und 572-648 Emission.
- Die Bilder wurden aufgenommen mit SlideBook 4,2 (Abbildung 1)
2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus mit weißem Licht.
3. Nehmen Sie das Bild mit Hilfe geeigneter Filter für jedes Fluorophor.
Repräsentative Ergebnisse
Repräsentative Bilder angezeigt werden (Abbildung 1). GFP Brennpunkte sollte gut definiert, während FM4-64-Färbung sollte hell und klar, 4-7. GFP oder Membran Bilder können pseudo-farbig mit einer beliebigen Farbe, um die höchste Bildqualität, ohne dass Daten verloren gehen vorgestellt werden können.
Abbildung 1: Repräsentative GFP Bilder von B. subtilis translationale Fusionsproteine. GFP-Proteine sind in grün dargestellt, während FM4-64 Membranfärbung in rot dargestellt wird. Der weiße Maßstab zeigt 3 mu m (A) MutS-GFP [relevant Genotyp: mutS - gfp (SPC), amyE: Pspac mutL (cat)]. In Gegenwart von 600 ug / mL 2-Amino-und 1 mM IPTG. FM4-64-Signal wird nicht dargestellt, um deutlicher zu zeigen, die MutS-GFP Brennpunkte (B) MutL-GFP [relevant Genotyp: mutL: mutL-GFP (SPC)].. In Gegenwart von 2-Amino (C) DnaX-GFP [relevant Genotyp: DnaX: DnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevant Genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] in Gegenwart von 20 ng / mL Mitomycin C (E) tagC-GFP [relevant Genotyp: tagC: tagC-GFP (SPC) ] in Gegenwart von 1 pg / mL Mitomycin C.
| Treatment / Konzentration oder Menge | Funktion | Die Zeit der Inkubation |
| Mitomycin C (MMC) [20 bis 150 ng / mL] | DNA Alkylierungsmittel | 1 Stunde |
| 2-Amino (2-AP) [600 ug / mL] | Missverhältnis zu induzieren | 1 Stunde |
| Hydroxyurea (HU) | erschöpft dNTPs | 3 Stunden |
| ultraviolettem Licht (UV) 20 J/m2 | Thymin-Thymin-Dimeren und 6-4 Photoprodukte | variiert je nach Quelle, in der Regel 20 Sekunden |
| Grau (ionisierende Strahlung) von 5 bis 100 Gy | Doppelstrangbrüche, Einzel-Strangbrüchen und Grundschaden Websites | variiert je nach Quelle |
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Multitest Rutsche, 15-gut | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Mikroskop Deckglas | Fischer | 12 bis 544-B | |
| Agarose | Fischer | BP160-500 | |
| Mitomycin C | Sigma | M0503-2MG | mutagen, Handschuhe tragen |
| 2-Amino | Sigma | A3509-250MG | Handschuhe |
| Hydroxyurea | Sigma | H8627-25G | Handschuhe |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | lichtempfindlich |
Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte:
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Discussion
Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Grenze belasten Differenzierung erschweren könnte, wenn mehrere Stämme auf dem gleichen Objektträger sind. Die Bildqualität ist direkt abhängig von der Qualität des Agarose-Pad, wo die Bakterien ruhen. Die Bilder von höchster Qualität wird aus Agarose-Pads erfasst werden, wo Bakterien nebeneinander. Pads, die die Bakterienzellen zu verklumpen und verhindert eine Monoschicht, wird zu schlechten Bildern. Pads, die zu dick sind wird einen hohen Hintergrund Fluoreszenzsignal, während Pads, die dehydriert sind, werden nicht für die Zellen richtig Ruhe zu ermöglichen. Diese Agarose pad Mängel werden in der Regel in einem sehr schlechten Bildqualität führen. Wenn ein gut produziert schlechte Bilder, einfach auf den nächsten gut bewegen. Es ist ideal, um zwischen 50 und 200 Zellen pro Bild aufzunehmen. Fluoreszenzmikroskopie hat eine Fülle von Informationen Detaillierung der zellulären Signale, dass die Montage der DNA-Reparatur und-Replikation Proteine in Herden in vivo zu lenken. Mit etwas Übung kann diese Technik erfolgreich an einer Vielzahl von Protein-Komplexe werden in vielen Bakterienarten angewendet.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten Drs danken. Philine S. Lee und Alan D. Grossman für zunächst Ausbildung LAS in der Fluoreszenzmikroskopie. Die Autoren danken Drs. Melanie Berkmen und Hajime Kobayashi um Hilfe und Tipps für die Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem College of Literature, Science & Arts und vom Department of Molecular, Cellular, und Entwicklungsbiologie an der University of Michigan unterstützt.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
