La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante
Summary
La cuantificación de ADN de doble filamento con la formación de estrías γH2AX como un marcador molecular se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos después de la exposición de las células a la radiación.
Abstract
ADN de doble filamento se rompe (DSBs), que son inducidas por cualquiera de los procesos metabólicos endógenos o por causas exógenas, son una de las lesiones del ADN más críticos con respecto a la supervivencia y la preservación de la integridad genómica. Una primera respuesta a la inducción de DSBs es la fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina-139 de residuos, en el altamente conservadas C-terminal motivo SQEY, formando γH2AX<sup> 1</sup>. Después de la inducción de DSBs, H2AX es rápidamente fosforilado por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PIKK) de la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionados (ATR)<sup> 2</sup>. Por lo general, sólo unos pocos pares de bases (pb) están implicados en un OSD, sin embargo, no hay amplificación de la señal significativa, dada la importancia de las modificaciones de la cromatina en la señalización de daño en el ADN y la reparación. La fosforilación de H2AX mediada predominantemente por ATM se extiende a las áreas adyacentes de la cromatina, que afecta a aproximadamente 0,03% del total de H2AX celulares por OSD<sup> 2,3</sup>. Esto corresponde a la fosforilación de aproximadamente 2000 moléculas H2AX que abarca ~ 2 Mbps regiones de la cromatina que rodea el sitio de la OSD y los resultados en la formación de focos discretos γH2AX que pueden ser fácilmente visualizados y cuantificados por microscopía de inmunofluorescencia<sup> 2</sup>. La pérdida de γH2AX al OSD refleja reparación, sin embargo, existe cierta controversia en cuanto a lo que define la reparación completa de DSBs, se ha propuesto que la reincorporación de las dos hebras de ADN es suficiente sin embargo, también se ha sugerido que restablecimiento de la cromatina estado original de la compactación es necesario<sup> 8.4</sup>. La desaparición de γH2AX implica al menos en parte, defosforilación por fosfatasas, fosfatasa 2A y 4C fosfatasa<sup> 5,6</sup>. Además, la eliminación de γH2AX de redistribución que implican el intercambio de histonas con H2A.Z se ha implicado<sup> 7,8</sup>. Es importante destacar que el análisis cuantitativo de los focos γH2AX ha llevado a una amplia gama de aplicaciones en la investigación médica y la energía nuclear. Este sentido, demuestran el método más comúnmente utilizado de inmunofluorescencia para la evaluación de daños en el ADN inicial de detección y cuantificación de γH2AX focos en γ-irradiados queratinocitos humanos adherentes<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
Después de la exposición a la radiación ionizante (rayos γ), γH2AX forma rápida los focos y los números de focos de alcanzar un máximo entre los 30-60 minutos 2. Por lo tanto, nuestra una hora después de la irradiación punto del tiempo refleja la formación inicial del OSD. Hemos utilizado la dosis de radiación clínicamente relevante de 2 Gy para nuestro experimento. Sin embargo, el método puede ser utilizado para la dosis de radiación hasta 4 Gy para la detección de la formación inicial del O…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
