電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化
Summary
分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。
Abstract
内因性の代謝プロセスによって、または外因性の要因によって誘発されるDNA二重鎖切断（DSB）は、ゲノムの完全性の生存と保全に関して、最も重要なDNA損傷の一つです。 DSBが誘導に早期の反応はγH2AXを形成し、高度に保存されたC末端SQEYモチーフに、セリン- 139残基において、H2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化です。<sup> 1</sup>。 DSBの誘導後、H2AXは急速にホスファチジル- inosito 3 – キナーゼ（PIKK）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連によってリン酸化される（ATR）<sup> 2</sup>。通常は、わずか数塩基対（bp）はDNA損傷のシグナル伝達と修復におけるクロマチン修飾の重要性に鑑み、しかし、重要な信号増幅があると、DSBに関与している。 H2AXのリン酸化はDSBごとの全細胞H2AXの約0.03％に影響を与える、クロマチンの隣接区域にATMスプレッドによって主に仲介<sup> 2,3</sup>。これは簡単に可視化し、免疫蛍光顕微鏡法で定量することができる離散γH2AX病巣の形成にDSBと結果のサイトを取り巻くクロマチンの〜2 MBP領域にまたがる約2000 H2AX分子のリン酸化に対応<sup> 2</sup>。 DSBでγH2AXの損失が修理を反映して、しかし、DSBが完全な修復を定義するものとして、いくつかの論争がある、それはDNAの両鎖の再結合は、それがものそれが再instatement示唆されている、しかし十分であることが提案されている圧縮のオリジナルのクロマチンの状態が必要です。<sup> 4月8日</sup>。 γH2AXのdisappearenceは、少なくとも部分的に含む、ホスファターゼ、ホスファターゼ2Aおよびホスファターゼ4Cによって脱リン酸化<sup> 5,6</sup>。さらに、H2A.Zとヒストン交換を含む再分配によってγH2AXの除去が関与している<sup> 7,8</sup>。重要なのは、γH2AX病巣の定量分析は、医療、原子力研究の幅広い用途につながっている。ここで、我々は、γ線照射接着ヒトケラチノサイトにおけるγH2AX巣の検出および定量することによって、初期DNA損傷の評価のための最も一般的に使用される蛍光抗体法を示す<sup> 9</sup>。
Protocol
Discussion
電離放射線（γ線）、急速にγH2AX巣の形と巣の番号への曝露後には30〜60分2との間で最大に達する。したがって、私たちの1時間照射後の時点では、初期のDSBの形成を反映している。我々は我々の実験に2 Gyの臨床的に関連する放射線量を使用している。しかし、方法は、初期のDSBの形成の検出を4 Gyに被曝線量のために、最大使用することができます。巣の大幅なオーバーラップは高用?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
