Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung
Summary
Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB), die entweder durch endogene Stoffwechselprozesse oder durch exogene Quellen hervorgerufen werden, sind eines der wichtigsten DNA-Schäden in Bezug auf das Überleben und die Erhaltung der genomischen Integrität. Eine frühe Reaktion auf die Induktion von DSB ist die Phosphorylierung des H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX<sup> 1</sup>. Nach Induktion von DSB ist H2AX schnell durch die Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PIKK) Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3 Zusammenhang phosphoryliert (ATR)<sup> 2</sup>. In der Regel sind nur wenige Basenpaare (bp) in einer DSB beteiligt, gibt es jedoch erhebliche Signalverstärkung, angesichts der Bedeutung des Chromatin-Modifikationen in der DNA-Schäden Signalisierung und zu reparieren. Die Phosphorylierung von H2AX vermittelt überwiegend von ATM-Spreads zu den angrenzenden Gebieten von Chromatin, die bei etwa 0,03% des gesamten zellulären H2AX pro DSB<sup> 2,3</sup>. Dies entspricht Phosphorylierung von etwa 2000 H2AX Moleküle Spanning ~ 2 Mbp Regionen des Chromatins um das Gelände des DSB und führt zur Bildung von diskreten γH2AX Herde, die leicht sichtbar gemacht und quantifiziert durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie kann<sup> 2</sup>. Der Verlust von γH2AX bei DSB spiegelt reparieren, jedoch gibt es einige Kontroversen darüber, was definiert komplette Reparatur von DSB, es wurde vorgeschlagen, dass Wiedereintritt der beiden DNA-Stränge ausreichend ist jedoch, wurde auch vorgeschlagen, dass Wiedereinsetzung des Original Chromatin Zustand der Verdichtung ist notwendig,<sup> 4-8</sup>. Das Verschwinden der γH2AX beinhaltet zumindest teilweise, Dephosphorylierung durch Phosphatasen, Phosphatase 2A und Phosphatase 4C<sup> 5,6</sup>. Darüber hinaus hat die Entfernung des γH2AX durch Umverteilung mit Histon-Austausch mit H2A.Z verwickelt<sup> 7,8</sup>. Wichtig ist, dass die quantitative Analyse der γH2AX Schwerpunkte, die eine breite Palette von Anwendungen in der Medizintechnik und der kerntechnischen Forschung geführt. Hier zeigen wir die am häufigsten verwendeten Immunfluoreszenz-Methode für die Bewertung der ersten DNA-Schäden durch den Nachweis und die Quantifizierung der γH2AX Brennpunkte in γ-bestrahlten adhärenten humanen Keratinozyten<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
Nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung (γ-Strahlen), γH2AX Brennpunkte bilden sich rasch und Schwerpunkte Zahlen erreichen ein Maximum zwischen 30-60 Minuten 2. Daher spiegelt unsere 1 Stunde nach der Bestrahlung Zeitpunkt anfänglichen DSB Bildung. Wir haben die klinisch relevante Strahlendosis von 2 Gy für unser Experiment verwendet. Allerdings kann das Verfahren zur Strahlendosis eingesetzt werden bis zu 4 Gy für den Nachweis von anfänglichen DSB Bildung; erhebliche Überschneidungen der H…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
