Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.
Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des zentralen Nervensystems. Für regenerative Zelltherapie in demyelinisierenden Erkrankungen, gibt es großes Interesse bei der Ableitung eines reinen Population von Lineage-committed Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) für die Transplantation. OPCs werden durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors Olig2 und Oberfläche Ausdruck eines Proteoglykan NG2 aus. Mit der GFP-Olig2 (G-Olig2) Maus embryonalen Stammzellen (MESC) Reporter Linie, optimierten wir die Bedingungen für die Differenzierung von mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In unserem Protokoll, beschreiben wir zunächst die Generierung von Embryoidkörpern (EVG) aus mESCs. Zweitens beschreiben wir die Behandlung von MESC-derived EBs mit kleinen Molekülen: (1) Retinsäure (RA) und (2) ein Sonic Hedgehog (SHH)-Agonist purmorphamine (Pur) unter definierten Kulturbedingungen zu EB Differenzierung in die oligodendroglialen Linie zu lenken. Mit diesem Ansatz kann OPCs mit hohem Wirkungsgrad (> 80%) in einem Zeitraum von 30 Tagen erreicht werden. Zellen aus mESCs in diesem Protokoll ergeben, sind phänotypisch ähnlich OPCs aus primärem Gewebe Kultur abgeleitet. Die MESC-derived OPCs zeigen nicht die Spikes-Eigenschaft für eine Subpopulation von Gehirn OPCs in situ beschrieben. Um dies zu untersuchen elektrophysiologische Eigenschaft beschreiben wir die Erzeugung von spiking MESC-derived OPCs von ektopisch auszudrücken Na<sub> V</sub> 1,2-Untereinheit. Der Spick und nonspiking Zellen aus diesem Protokoll erhalten wird vorab funktionelle Untersuchungen an den beiden Subpopulationen von OPCs zu helfen.
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), aus einer Blastozyste Embryo isoliert, kann in allen Zelllinien des Organismus 3, 4 zu unterscheiden, bietet ein in vitro Modell für die Erforschung von frühen Entwicklung von Säugetieren, einschließlich Oligodendrozyten-Spezifikation. mESCs haben gezeigt, dass in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) mit der Behandlung von Sonic Hedgehog (SHH) 5 zu unterscheiden. Darüber hinaus behält sich das Shh-induzierten OPC Differenzierung von mESCs das richtige Timing bei der Embryonalentwicklung 6 beobachtet. Daher ist die Art der In-vitro-Differenzierung von OPC mESCs als im Einklang mit dem, was von in vivo Entwicklung gelernt. Hier mit dem kleinen Molekülen RA und die Shh-Agonisten Pur, haben wir erfolgreich die G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad unterschieden.
OPCs, durch den Ausdruck der Proteoglykan NG2 7 und die Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor Olig2 8 gekennzeichnet, erzeugen Oligodendrozyten in den Entwicklungsländern und reifen ZNS, wo sie einen bedeutenden Prozentsatz (~ 5%) der gesamten Zellen und enthalten, sind die Haupt-proliferierenden Zelltyp 9. Seit fast zwei Jahrzehnten haben Forscher Na V-Kanäle gezeigt werden in einer Subpopulation von OPCs zum Ausdruck und kann auf Depolarisation 10, 11 aktiviert werden. Darüber hinaus wurde kürzlich bemerkenswerte Beobachtung 9, die in in situ Ratte CNS weißen Substanz, OPCs (~ 50%) Aktionspotenziale erzeugt, wenn depolarisiert abhängig von der Expression von spannungsabhängigen Natrium (Na V) Kanäle, und so konnte in spiking unterteilt werden und nonspiking Subpopulationen. Allerdings sind die Funktionen dieser spiking Eigenschaften noch weitgehend unbekannt. Wir fanden, dass, elektrophysiologisch, die MESC-derived OPCs mit dem Shh-abhängigen Protokoll differenzierte, nicht die gleiche wie die in situ Gehirn OPCs. Nach der Einführung Untereinheit Na V 1.2 wurden diese stille MESC-derived OPCs in der Lage spiking.
So kann das Aufstocken / nonspiking MESC-derived OPCs und Differenzierung hier beschriebene Protokoll (1) Untersuchung der funktionellen Unterschiede zwischen Spike und nonspiking OPCs, (2) Screening neuer Faktoren, die Natrium-Kanal Ausdruck in der MESC-derived OPCs, fördern könnte zu erleichtern ( 3) Entwicklung und Optimierung der Differenzierung Protokoll der OPCs aus menschlichem ESC oder induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse zu WD von National Institutes of Health (RO1 NS059043 und RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anämie Research, Feldstein Medical Foundation und der Shriners Hospitals for Children unterstützt.
Wir möchten Dr. David Pleasure und Jennifer Flugzeug für Anregungen bedanken. Wir erklären, keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit diesem Artikel.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |