Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.
Oligodendrócitos são as células myelinating do sistema nervoso central. Para terapia celular regenerativa em doenças desmielinizantes, há um interesse significativo na derivação de uma população pura de linhagem comprometida células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) para transplante. OPCs são caracterizadas pela atividade da Olig2 fator de transcrição e expressão de superfície de um proteoglicano NG2. Usando o GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse com células-tronco embrionárias (MESC), linha repórter, nós otimizamos as condições para a diferenciação de mESCs em GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. Em nosso protocolo, primeiro descrever a geração de corpos embrióides (EBs) de mESCs. Segunda, descrevemos o tratamento de MESC derivados EBs com pequenas moléculas: (1) ácido retinóico (AR) e (2) um ouriço sónico purmorphamine agonista (Shh) (Pur), sob condições de cultura definidas para direcionar a diferenciação EB na linhagem oligodendroglial. Por esta abordagem, OPCs pode ser obtido com alta eficiência (> 80%) em um período de 30 dias. Células derivadas de mESCs neste protocolo são fenotipicamente semelhante a OPCs derivados de cultura de tecidos primários. O OPCs MESC derivados não apresentam a propriedade spiking descrito para uma subpopulação de OPCs cérebro in situ. Para estudar esta propriedade eletrofisiológicos, descrevemos a geração de spiking MESC derivados OPCs por ectopicamente expressando Na<sub> V</sub> 1,2 subunidade. As células spiking e nonspiking obtidos a partir deste protocolo vai ajudar a avançar os estudos funcionais sobre as duas subpopulações de OPCs.
Células-tronco embrionárias (CES), isolado a partir de um embrião de blastocisto, podem se diferenciar em todas as linhagens de células do organismo 3, 4, provendo uma in vitro sistema modelo para estudar o desenvolvimento de mamíferos adiantados, incluindo especificação de oligodendrócitos. mESCs foram mostrados para se diferenciar em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) com o tratamento de sonic hedgehog (Shh) 5. Além disso, o Shh induzida diferenciação OPC a partir mESCs mantém o timing correto observado no desenvolvimento embrionário 6. Assim, a natureza da diferenciação in vitro de mESCs OPC é considerado para ser coerente com o que foi aprendido com desenvolvimento de vivo. Aqui, usando a pequenas moléculas RA eo Pur agonista Shh, conseguimos diferenciada do mESCs G-Olig2 em GFP + + Olig2 NG2 + OPCs com alta eficiência.
OPCs, caracterizado pela expressão do proteoglicano NG2 7 e do fator de transcrição hélice-alça-hélice Olig2 8, gerar oligodendrócitos no SNC em desenvolvimento e maduras, onde constituem uma percentagem significativa (~ 5%) do total de células e são os principal tipo de célula em proliferação 9. Por quase duas décadas pesquisadores demonstraram Na canais V são expressos em uma subpopulação de OPCs e pode ser activado a despolarização 10, 11. Além disso, uma observação recente impressionante foi que em 9 no SNC de ratos situ substância branca, OPCs (~ 50%) gerados potenciais de ação quando despolarizada, dependendo da expressão de voltagem-dependentes de sódio (Na V) canais, e, portanto, poderia ser subdividida em spiking e nonspiking subpopulações. No entanto, as funções dessas propriedades spiking são ainda desconhecidos. Descobrimos que, eletrofisiologicamente, o MESC OPCs derivados diferenciada com o protocolo Shh-dependente, não eram o mesmo que o cérebro em OPCs situ. Depois de introduzir subunidade Na V 1.2, estas silêncio MESC derivados OPCs eram capazes de spiking.
Assim, o spiking / nonspiking MESC derivados OPCs e protocolo de diferenciação descrito aqui pode facilitar (1) estudar as diferenças funcionais entre spiking e nonspiking OPCs, (2) fatores de triagem novo que poderia promover a expressão dos canais de sódio na OPCs MESC derivados, ( 3) desenvolver e optimizar o protocolo de diferenciação de OPCs de humano ESC ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi em parte suportado por concessões para WD de National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), Multiple Sclerosis Society Nacional, Fundação Roche para Anemia Research, Medical Foundation Feldstein, e os Hospitais Shriners para Crianças.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Prazer e Jennifer Plane para sugestões. Declaramos a inexistência de interesses concorrentes relacionados para este artigo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |