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Immunology and Infection

THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65903
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, Araraquara, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Social Dentistry, School of Dentistry, Araraquara, São Paulo State University (UNESP)

Summary

Ce protocole décrit l’application de la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) dans un modèle murin de candidose buccale. L’aPDT a été réalisée à l’aide d’un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes et de lumière LED bleue.

Abstract

La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) a été largement étudiée in vitro, et les modèles animaux précliniques d’infections conviennent à l’évaluation de traitements alternatifs avant les essais cliniques. Cette étude décrit l’efficacité de l’aPDT dans un modèle murin de candidose buccale. Quarante souris ont été immunodéprimées avec des injections sous-cutanées de prednisolone, et leur langue a été inoculée à l’aide d’un écouvillon buccal préalablement trempé dans une suspension de cellules de C. albicans . La tétracycline a été administrée par l’eau potable au cours de l’expérience. Cinq jours après l’inoculation fongique, les souris ont été réparties au hasard en huit groupes ; Un neuvième groupe de souris non traitées et non infectées a été inclus comme témoin négatif (n = 5). Trois concentrations (20 μM, 40 μM et 80 μM) d’un mélange de curcuminoïdes ont été testées avec une lumière LED bleue (89,2 mW/cm2 ; ~455 nm) et sans lumière (groupes C+L+ et C+L-, respectivement). Des animaux légers seuls (C-L+), aucun traitement (C-L-) et des animaux sans infection ont été évalués comme témoins. Les données ont été analysées à l’aide de l’ANOVA de Welch et des tests Games-Howell (α = 0,05). La candidose buccale a été établie chez tous les animaux infectés et visualisée macroscopiquement par la présence de taches blanches ou de pseudomembranes caractéristiques sur le dos de la langue. Les coupes histopathologiques ont confirmé une forte présence de levures et de filaments limités à la couche kératinisée de l’épithélium dans le groupe C-L-, et la présence de cellules fongiques a été visuellement diminuée dans les images obtenues de souris soumises à l’aPDT avec des curcuminoïdes de 40 μM ou 80 μM. L’aPDT médiée par des curcuminoïdes de 80 μM a favorisé une réduction de 2,47 log10 du nombre de colonies par rapport à celles du groupe C-L- (p = 0,008). Tous les autres groupes n’ont montré aucune réduction statistiquement significative du nombre de colonies, y compris les groupes photosensibilisants (C+L-) ou légers seuls (C-L+). L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a réduit la charge fongique de la langue des souris.

Introduction

La candidose buccale (CO) est la principale infection fongique de la cavité buccale ; elle est causée par la prolifération de Candida spp. Les facteurs prédisposant à la contraceptive orgueilleux comprennent le dysfonctionnement endocrinien, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre, la radiothérapie et la chimiothérapie, les carences nutritionnelles, la xérostomie (faible débit salivaire), l’utilisation de prothèses dentaires, une mauvaise hygiène et, surtout, l’immunosuppression1. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est la plus répandue et la plus virulente ; On le trouve comme espèce commensale dans le corps humain et comme agent pathogène opportuniste. C. albicans a la capacité de changer sa morphologie de levures commensales (blastopores) en filaments pathogènes (hyphes et pseudohyphes)2. Les formes filamenteuses, en particulier les hyphes, peuvent envahir l’épithélium de l’hôte par endocytose ou pénétration active, provoquant une infection3. Les autres facteurs de virulence de C. albicans comprennent l’adhésion, la formation de biofilm et la sécrétion d’enzymes et de toxines lipolytiques et hydrolytiques, telles que les lipases, les phospholipases, les protéinases et la candidalysine4.

Les traitements par CO impliquent l’utilisation d’agents antifongiques, en particulier des polyènes topiques et des azoles (nystatine et miconazole)5. Cependant, ils ne montrent qu’une efficacité à court terme et les récidives sont fréquentes. De plus, la surutilisation d’antifongiques a donné lieu au problème du développement et de la propagation de la résistance aux antifongiques6. Par conséquent, des thérapies alternatives sont nécessaires, telles que la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa), qui combine un photosensibilisateur (PS) et une lumière à une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) en présence d’oxygène. Les PS sont liées aux cellules ou absorbées par elles et, lorsqu’elles sont activées par la lumière, produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont toxiques pour les cellules sensibilisées7.

Dans l’aPDT, l’un des photosensibilisants (PS) utilisés est la curcumine (CUR), un composé naturel extrait des rhizomes de la plante de curcuma (Curcuma longa L.). La curcumine possède de nombreux attributs thérapeutiques, notamment des capacités anti-inflammatoires, antioxydantes, anticancéreuses et antimicrobiennes 8,9. Une étude antérieure a révélé que l’aPDT utilisant CUR diminuait efficacement C. albicans dans un modèle murin de candidose buccale sans causer de dommages aux tissus de l’hôte10. Le CUR est le principal curcuminoïde extrait du curcuma, mais d’autres polyphénols, tels que la déméthoxycurcumine et la bis-déméthoxycurcumine, se trouvent également dans cette plante. L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a démontré une activité antibactérienne contre les biofilms de Staphylococcus aureus cultivés dans des cathéters11. Cependant, à notre connaissance, son activité antifongique contre C. albicans reste incertaine. Par conséquent, dans cette étude, nous avons évalué l’aPDT médiée par un sel curcuminoïde contre C. albicans dans un modèle murin de CO.

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Protocol

Le protocole de recherche pour l’utilisation des souris a été approuvé par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux (numéros de cas 05/2008 et 09/2020) à l’École de médecine dentaire d’Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) a été utilisé comme souche de référence. Des souris suisses femelles de six semaines (n = 45), avec une masse corporelle comprise entre 20 et 30 g, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été fournis par l’Université d’État de São Paulo, UNESP, Botucatu.

1. Préparation du PS et sélection de la source lumineuse pour l’aPDT

  1. Préparer le PS selon les spécifications de la substance à tester.
    REMARQUE : Dans cette étude, un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes (mélange de sels hydrosolubles à base de CUR12) a été utilisé comme PS (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Des dilutions à 20 μM, 40 μM et 80 μM (15,6, 29,2 et 58,4 mg/L, respectivement) ont été préparées dans de l’eau ultra-pure immédiatement avant utilisation et maintenues à 5 °C.
  2. Choisir un équipement lumineux avec une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) capable d’éclairer l’ensemble de la cible photosensibilisée uniformément et simultanément sans chauffer le tissu.
    NOTE : Dans cette étude, une pièce à main contenant une diode électroluminescente (LED, voir Tableau des matériaux), qui a été conçue à l’Instituto de Física de São Carlos (Université de São Paulo, São Carlos, SP, Brésil), a été utilisée. La puissance de sortie délivrée par la lumière était de 89,2 mW/cm2 à une longueur d’onde bleue d’environ 455 nm.

2. Préparation de l’inoculum de C. albicans

  1. Conserver la souche de référence C. albicans (ATCC 90028) dans de la levure-peptone-glucose (YEPD, voir le tableau des matières) avec 50 % de glycérol à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
  2. Décongeler la souche congelée à température ambiante, étaler une aliquote de 100 μL sur une boîte de Pétri avec de la gélose au dextrose de Sabouraud (SDA) avec du chloramphénicol (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 48 h.
  3. Transvaser cinq colonies dans 10 mL de bouillon d’azote de levure avec un milieu à 2 % de glucose (YNBg) et faire croître en aérobie à 37 °C pendant 16 h.
  4. Diluer la culture de levure dans du YNBg frais (1 :10) et incuber en aérobie à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique atteigne la phase de croissance moyenne logarithmique.
    REMARQUE : Normaliser la courbe de croissance microbienne pour chaque laboratoire au préalable. Dans la recherche actuelle, les cultures ont été laissées incuber pendant environ 8 h, jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance mi-logarithmique indiquée par la densité optique à 540 nm (OD540), avec une valeur moyenne de 0,536 ± 0,062 unités arbitraires (moyenne ±écart-type [ET]).
  5. Centrifuger la culture à 5 000 x g à température ambiante pendant 5 min, jeter le surnageant et laver la pastille deux fois avec le même volume de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS ; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).
  6. Utiliser des aliquotes de 100 μL pour effectuer quatre dilutions en série de 10 fois dans du PBS, étaler les dilutions sur des plaques SDA et incuber à 37 °C pendant 48 h pour le comptage des colonies. En standard, les suspensions fongiques sont utilisées à des concentrations d’environ 4,5 × 107 unités formant colonies par millilitre (UFC/mL)].

3. Induction du CO chez la souris

NOTE : La méthodologie suivante a été décrite précédemment par Takakura et al.13 et reproduite par notre groupe10,14, avec quelques modifications.

  1. Répartir aléatoirement les souris en neuf groupes (n = 5), correspondant au même nombre de traitements (fichier supplémentaire 1).
    REMARQUE : La cavité buccale des souris doit être négative pour la croissance de Candida . Cela doit être vérifié en écouvillonnant la cavité buccale et en plaquant l’échantillon sur SDA.
  2. Conservez les animaux dans des boîtes à propylène10 (5 souris par boîte max.), avec des copeaux de bois pour le revêtement de sol, dans un vivarium à température contrôlée à 23 ± 2 °C sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. Aucun enrichissement spécifique n’est nécessaire.
  3. Maintenir les souris avec un régime de souris extrudé et de l’eau filtrée à volonté.
  4. Injecter par voie sous-cutanée le médicament immunosuppresseur, la prednisolone (100 mg/kg de poids corporel, voir le tableau des matières), pour la première fois le premier jour à tous les membres des groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1).
    REMARQUE : Gardez les souris du même groupe dans la même boîte et surveillez-les quotidiennement pour tout signe de stress et de perte de poids. Demandez l’avis d’un vétérinaire pour un analgésique ou une modification de la nourriture ou de l’eau si vous remarquez un stress ou une perte de poids.
  5. Dès le premier jour et jusqu’à la fin de l’expérience, fournir du chlorhydrate de tétracycline dans l’eau potable à raison de 0,83 mg/mL13.
  6. Inoculer des langues de souris le deuxième jour, y compris les groupes C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ et C-L- (Fichier supplémentaire 1), avec l’inoculum de C. albicans . N’inoculez pas ces souris du groupe témoin négatif (NCtrl).
    1. Animaux sous sédatif par injection intramusculaire de chlorure de chlorpromazine 10 mg/kg (voir tableau des matières) sur chaque muscle de la cuisse avant de procéder à l’inoculation.
    2. Effectuer l’inoculation intrabuccale des souris en trempant un écouvillon stérile (un par animal) dans une suspension normalisée de C. albicans fraîchement préparée (c.-à-d. préparée immédiatement avant l’inoculation).
    3. Placez les souris sous sédation en position couchée. Retirez doucement leur langue de leur bouche à l’aide d’une pince stérile. Frottez la langue de chaque souris avec un tampon imbibé pendant 30 s. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de la sédation.
  7. Le cinquième jour, administrer une injection sous-cutanée complémentaire de prednisolone (100 mg/kg de poids corporel) pour maintenir l’immunosuppression.
    REMARQUE : Ce protocole est adéquat pour maintenir l’infection pendant 7 jours après l’inoculation intraorale. La chronologie du protocole est illustrée à la figure 2.

4. Thérapie photodynamique antimicrobienne et récupération de C. albicans à partir de lésions buccales

  1. Le septième jour, avant le traitement, anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) combiné à de la xylazine (10 mg/kg de poids corporel) (voir le tableau des matières).
  2. Placez chaque animal en position couchée sur un dispositifde coussinets 14,15 équipé de fils en acier inoxydable qui peuvent être enroulés autour des incisives pour garder la bouche ouverte.
    REMARQUE : Les coussinets isothermes sont recommandés pour réchauffer les souris pendant qu’elles sont sous sédation, prévenir l’hypothermie à température ambiante et éviter la mortalité liée à l’anesthésie15. Chaque animal anesthésié doit être surveillé en l’absence de réflexe de retrait lorsque les orteils sont pincés pour confirmer la profondeur de l’anesthésie. Une dose d’entretien de kétamine à 1/3 de la dose initiale (sans xylazine) peut être administrée si nécessaire.
  3. Avec la mandibule et les joues rétractées, placez doucement la langue à l’extérieur de la bouche.
  4. Pour les souris des groupes C+L+, pipeter 70 μL de PS sur le dos de la langue (à l’une des concentrations testées). Maintenez les souris dans un environnement sombre pendant une durée de 20 minutes en période de pré-irradiation. Assurez-vous que pendant ce temps, la langue de chaque animal reste positionnée à l’intérieur de la cavité buccale pour éviter l’ingestion du photosensibilisateur (PS).
  5. Après la période de photosensibilisation, retirez la langue de la bouche pour l’éclairer. Placez le dispositif LED sur le dos de la langue et allumez-le à 37,5 J/cm2 (7 min avec le présent appareil) (Figure 3).
  6. Pour les animaux des groupes C+L-, pipeter 70 μL de PS à l’une des concentrations testées sur le dos de la langue, et garder ces souris dans l’obscurité pendant 27 min.
  7. Pour les animaux du groupe C-L+ (traités à la lumière sans photosensibilisation préalable), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue. Gardez les souris dans l’obscurité pendant 20 min puis éclairez leur langue à 37,5 J/cm2 (7 min avec le présent appareil).
  8. Pour les souris du groupe C-L- (non traitées au PS ni à la lumière), pipeter 70 μL de solution saline stérile sur le dos de la langue et les maintenir dans l’obscurité pendant 27 min.
  9. Récupérer C. albicans de la langue de toutes les souris immédiatement après le traitement. Écouvillonner le dos de la langue pendant 1 min avec un coton-tige stérile.
  10. Placer chaque écouvillon dans un tube contenant 1 mL de solution saline stérile et agiter pendant 1 min pour remettre les cellules microbiennes en suspension.
  11. Effectuer immédiatement des dilutions en série de 10 fois dans du PBS et des aliquotes de 25 μL sur des plaques SDA en double. Incuber les plaques en aérobie à 37 °C pendant 48 h.
  12. Après 48 h, utilisez un compteur de colonies numérique (voir Tableau des matières) pour déterminer le nombre de colonies de levures. Calculer la charge de C. albicans (UFC/mL) pour chaque animal.
  13. Transformer les valeurs UFC/mL en log10 et analyser correctement selon le plan de l’expérience et les hypothèses de données.
    REMARQUE : Dans la présente étude, l’ANOVA à un facteur de Welch et le test post-hoc Games-Howell (α = 0,05)16 ont été utilisés.

5. Analyses histopathologiques

  1. Le huitième jour, anesthésier les souris avec de la kétamine à 100 mg/kg combinée à de la xylazine à 10 mg/kg par injection intrapéritonienne et les euthanasier avec une surdose de kétamine (200 mg/kg administrée par voie intrapéritonienne). Confirmez le décès en vérifiant l’absence de mouvement respiratoire (apnée) et l’absence de battement cardiaque (asystole).
  2. Pincez délicatement la langue et retirez-la de la bouche de l’animal. À l’aide d’un scalpel manuel, faites une incision avant les papilles circonvallées pour retirer chirurgicalement toute la langue sans causer de blessures aux régions antérieure et centrale.
  3. Fixez la langue dans du formol tamponné à 10 % (pH 7,2-7,4) pendant 24 h et lavez-la à l’eau courante pendant 2 h.
  4. Procéder à l’inclusion dans le processus de paraffine : déshydratation, clarification et imprégnation10,14.
  5. Couper des coupes en série (5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome, puis fixer les sections sur des lames de verre. Procéder à la coloration de ces coupes à l’aide d’acide Schiff périodique et d’hématoxyline (PAS-H) pour l’examen histopathologique et l’identification des champignons par observation au microscope optique.
  6. Demandez à un pathologiste, de préférence aveugle aux groupes étudiés, d’examiner la réaction tissulaire due à une infection à C. albicans .
  7. Décrire les caractéristiques histologiques du tissu (épithélium et tissu conjonctif), en particulier les réponses inflammatoires locales d’intensité variable.

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Representative Results

Le modèle murin de CO a montré des taches blanches et des pseudomembranes typiques sur la langue de toutes les souris infectées (Figure 4A). Les C. albicans récupérés sur des animaux C-L- ont confirmé la colonisation tissulaire par ce microorganisme (les valeurs variaient de 1,62 x 104 à 4,80 x 105 UFC/mL). Comme prévu, les animaux du groupe NCtr n’ont montré aucune altération tissulaire ou croissance de la colonie après l’échantillonnage (figure 4B).

La TPa a diminué la viabilité de C. albicans lorsque les curcuminoïdes ont été utilisés à 80 μM pour la photosensibilisation (figure 5). La réduction moyenne du log10 obtenue avec l’aPDT médiée par le PS de 80 μM était de 2,47, par rapport à celle du groupe C-L- (p = 0,008).

Le nombre de colonies de C. albicans récupérées sur la langue des souris n’était pas significativement différent entre les souris traitées avec des curcuminoïdes sans éclairage (groupes C+L-), les souris traitées avec la lumière mais non photosensibilisées auparavant (groupes C-L+) et les souris non traitées (groupe C-L-) (p ≥ 0,210).

Les caractéristiques histologiques de la langue d’animaux non infectés (NCtr) ont montré des tissus normaux/sains, y compris une lamina propria, une membrane basale et des papilles filiformes intactes (Figure 6A). En revanche, lors de l’examen des images histopathologiques des langues des souris du groupe C-L-, il était évident que des levures et des filaments étaient présents dans la couche kératinisée de l’épithélium, bien qu’il n’y ait pas eu d’infiltration de champignons. Dans le tissu conjonctif sous-jacent, une légère réponse inflammatoire a été observée, principalement médiée par des cellules mononucléaires, et les papilles filiformes étaient remarquablement absentes (Figure 6B). L’analyse histologique des langues des souris des groupes C+L- et C-L+ a montré des caractéristiques similaires. En revanche, les sections de langue de souris traitées avec 80 μM d’aPDT médiée par curcuminoïde ont révélé un nombre réduit de cellules fongiques, principalement limitées à la couche kératinisée de l’épithélium (Figure 6C).

Figure 1
Figure 1 : Structure chimique du photosensibilisateur. Structure chimique du mélange de sels hydrosolubles utilisé comme photosensibilisant, comprenant 53,4 % de curcumine naturelle et 46,6 % d’autres curcuminoïdes (déméthoxycurcumine et bis-déméthoxycurcumine). La masse moléculaire moyenne finale est de 730,32 g/mol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chronologie du protocole pour le modèle murin de candidose buccale et de TPDa. Une chronologie décrivant le protocole pour le modèle murin de candidose buccale et la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Illumination de la langue de souris après photosensibilisation. Après la photosensibilisation (incubation du tissu infecté avec le photosensibilisateur), les langues ont été éclairées à 37,5 J/cm2 à l’aide d’une lumière LED bleue (~455 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Lésions blanches dans le modèle murin de candidose buccale. (A) Images représentatives illustrant les lésions blanches observées dans le modèle murin de candidose buccale. (B) Contrôle négatif (non infecté). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Candida albicans récupéré sur la langue de souris. Les données représentent les valeurs moyennes ±écart-type de log10(UFC/mL) des groupes de traitement. L’ANOVA à un facteur de Welch a indiqué que les effets des traitements étaient statistiquement significativement différents entre les groupes (p < 0,001). Différentes lettres minuscules (a, b, c) à côté des moyennes indiquent des différences statistiquement significatives selon le test Games-Howell (p≤ 0,030). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Images représentatives de coupes histologiques de langues de souris. Des coupes histologiques de langues de souris ont été colorées avec PAS-H, et les images ont été capturées à 200x. (A) Souris témoins négatives sans candidose buccale induite, photosensibilisation et illumination (groupe NCtr). (B) Souris atteintes de candidose buccale induite, non photosensibilisées ni exposées à l’éclairage LED (groupe C-L). (C) Animaux atteints de candidose buccale induite, exposés à des curcuminoïdes de 80 μM et à un éclairage LED de 37,5 J/cm2 (groupe C+L+ 80). Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Groupes expérimentaux. Une liste des groupes expérimentaux utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

C. albicans a été associé à des infections buccales et œsophagiennes chez les personnes immunodéprimées, au diabète sucré, à l’utilisation prolongée d’antibiotiques et à une mauvaise hygiène bucco-dentaire 1,3. L’étude des maladies infectieuses humaines nécessite des investigations in vitro et in vivo avant que les essais cliniques puissent être conçus de manière sûre et précise. La présente étude décrit une méthode d’établissement d’un modèle murin de CO, qui peut être utilisé pour évaluer la pathogenèse des infections buccales par C. albicans et l’efficacité des approches antifongiques 15,16,17,18,19.

Le modèle murin de CO utilisé ici a été établi avec succès, comme en témoignent la récupération substantielle de la charge fongique des lésions ainsi que les caractéristiques de l’infection observées dans les analyses macroscopiques et histopathologiques de la langue des souris infectées. De nombreuses études ont utilisé des modèles murins similaires de CO. Dans de tels modèles, les souris femelles sont immunodéprimées et inoculées avec C. albicans, ce qui entraîne des lésions sur la langue 10,13,14,15,20,21. L’immunosuppression par la prednisolone, un glucocorticoïde, inhibe l’activité des neutrophiles contre C. albicans22. Dans cette étude, des souris femelles ont été immunodéprimées avec deux injections sous-cutanées de prednisolone, un jour avant et trois jours après l’infection à C. albicans13. De plus, l’administration de tétracycline dans l’eau potable au cours de l’expérience a provoqué une dysbiose buccale en perturbant les bactéries buccales et en aidant C. albicans à se développer23,24. De plus, la sédation causée par l’injection intramusculaire de chlorure de chlorpromazine empêchait les animaux de boire de l’eau et de manger immédiatement après l’inoculation. Ainsi, les cellules fongiques sont restées plus longtemps en contact avec le dos de la langue, permettant le développement de tubes germinatifs et la transition des levures aux filaments (hyphes et pseudohyphes), qui sont les morphologies pathogènes de C. albicans qui peuvent envahir l’épithélium humain. Teichert et coll.25 ont utilisé un protocole d’immunodéficience pour induire la contraceptivité orsale chez la souris et n’ont récupéré que 2 x 102 UFC/mL de C. albicans.

Bien que Totti et al.26 aient utilisé des souris sialoadenectomisées et effectué quatre inoculations distinctes avec une suspension de C. albicans , il convient de noter que, dans leur cas, l’infection n’a pas été maintenue chez la plupart des animaux au cours de l’expérience. En revanche, dans la présente étude, l’inoculation de cellules fongiques n’a été effectuée qu’une seule fois, et elle a permis de récupérer 104 UFC/mL de C. albicans dans la cavité buccale. Cette étude a utilisé le modèle murin de candidose décrit par Takakura et coll.13, qui ont effectué l’inoculation orale d’une souche clinique isolée d’un patient atteint de candidose cutanée (106 UFC/mL). Trois à sept jours après l’inoculation, 105-10 6 UFC/mL de C. albicans ont été récupérés dans la cavité buccale des souris13. Les différences entre la méthode de Takakura et al.13 et la présente étude comprennent l’utilisation de différentes concentrations fongiques dans l’inoculum (cette étude a utilisé 10à 7 UFC/mL de C. albicans) et différentes souches de C. albicans pour l’inoculation orale (la souche de référence ATCC 90028 a été utilisée ici). Carmello et al.20 ont utilisé un protocole similaire, qui impliquait l’utilisation d’animaux immunodéprimés. Cependant, ils ont administré deux injections sous-cutanées supplémentaires de prednisolone aux animaux les jours 1, 5, 9 et 13 de l’expérience. Leur étude a révélé une corrélation positive entre les scores attribués aux lésions buccales des animaux infectés et le nombre d’UFC/mL sur une période allant de 5 à 16 jours après l’infection. Il a été bien établi dans des recherches antérieures qu’il est crucial de surveiller de près les animaux sous anesthésie pour prévenir l’hypothermie. Des doses d’entretien supplémentaires de kétamine doivent être administrées avec discrétion, uniquement lorsque cela est nécessaire27.

En ce qui concerne l’efficacité de l’application de l’aPDT, les résultats ont montré que l’irradiation de langues préalablement traitées avec un mélange de sels de curcuminoïdes de 80 μM entraînait une réduction significative (2,47 log10) de la viabilité de C. albicans. Les analyses histologiques ont révélé que des coupes de langues traitées avec 80 μM d’aPDT médiée par curcuminoïde présentaient un nombre réduit de cellules fongiques, qui étaient limitées à la couche kératinisée, et une faible réponse inflammatoire. Il convient de souligner qu’une réponse inflammatoire a été détectée chez toutes les souris infectées par C. albicans. Cette observation implique que l’inflammation observée dans tous les groupes aPDT pourrait être liée à une infection à Candida plutôt que d’être attribuée à l’aPDT, une conclusion cohérente en accord avec nos recherches antérieures 10,13,14,15.

Des études antérieures ont utilisé le CUR, le bleu de méthylène et la photodithazine (PDZ) comme PS et ont obtenu des résultats prometteurs 10,20,24,25,27. Dans une étude similaire10, une exposition combinée à la lumière CUR et à la lumière LED a entraîné une réduction significative de la viabilité de C. albicans ; cependant, l’utilisation de 80 μM de CUR et de lumière a réduit la viabilité fongique de 4,0 log10. Dovigo et al.10 n’ont utilisé que CUR comme PS, alors que nous avons utilisé un sel contenant les trois principaux curcuminoïdes de C. longa. Lorsque le CUR (260 μM) et la lumière LED ont été utilisés pendant cinq jours consécutifs dans le traitement de la candidose buccale chez la souris, les auteurs ont observé une réduction de 1,11 log10 de la viabilité fongique21. Lorsque le bleu de méthylène a été utilisé comme PS à 450 μg/mL et 500 μg/mL, l’aPDT a totalement éradiqué C. albicans de la cavité buccale des souris25. De plus, lorsque l’aPDT était médiée par la PDZ (100 mg/L), une réduction de 3,0 log10 et une rémission complète des lésions buccales ont été observées20. De plus, l’aPDT a augmenté l’expression du TNF-α par rapport à celle du groupe20 non traité. Dans une étude où une souche résistante au fluconazole a été utilisée, l’aPDT médiée par la PDZ (200 mg/L) a favorisé une réduction équivalente à 1,3 log1027. De plus, la combinaison de l’aPDT et de la nystatine a entraîné une réduction substantielle de la viabilité fongique, soit une diminution de 2,6 log10, ainsi que des améliorations notables des lésions buccales et une réduction de la réponse inflammatoire27. Collectivement, ces études fournissent des preuves convaincantes de l’efficacité de l’aPDT dans la réduction de la charge fongique dans le modèle murin de candidose buccale, soulignant son potentiel en tant qu’option de traitement clinique en raison de son efficacité antimicrobienne sans nuire aux tissus de l’hôte.

En conclusion, le modèle murin de CO utilisé dans cette étude est approprié pour imiter l’infection et évaluer l’efficacité de l’aPDT. Par conséquent, le modèle OC utilisé ici n’a utilisé qu’une seule souche de référence de C. albicans (les autres souches, les isolats cliniques et les espèces de Candida non albicans n’ont pas été évalués). De plus, l’immunosuppression induite par les corticostéroïdes utilisée chez les souris pour développer une infection buccale peut ne pas imiter d’autres états d’immunodéficience, tels que celui dû à l’infection par le VIH. Il peut également y avoir des différences dans les conditions de l’hôte pour développer le CO, comme le microbiote buccal des souris et des humains. Ce protocole devrait être élargi pour évaluer les biofilms mixtes formés par plus d’une espèce ou par différentes souches d’une même espèce. De plus, garder les souris sous sédation adéquate et prévenir l’hypothermie tout en évitant la mortalité liée à l’anesthésie sont les étapes les plus difficiles du protocole.

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Acknowledgments

Les auteurs remercient la FAPESP (Fondation de recherche de São Paulo, numéro de processus FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) et 2008/00601-6. Nous remercions également le Dr Ana Paula Silva pour avoir fourni les informations sur le sel soluble dans l’eau à base de CUR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. albicans ATCC (Rockville, Md, USA) 90028 Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany 022628146 (NA) Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil  -   Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt PDTPharma, Cravinhos, Brazil  -  Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil  -  Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.  - Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10% Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil  -  Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype) Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil  -  Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg DEPO-MEDROL, Pfizer, New York  -  Used as an immunosuppressant
Microtome Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA SM2500 Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil  -  Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol HiMedia, Mumbai, India MM1067-500G Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil K37-VIS  Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride  Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil  -  Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil  - Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2% Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil  -  Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth  Difco, InterLab, Detroit, MI, USA DF0919-07-3  Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth NutriSelect Basic, Sigma Aldrich Y1375 Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow

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References

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Médiation par les curcuminoïdes thérapie photodynamique antimicrobienne modèle murin candidose buccale APDT in vitro modèles animaux précliniques traitements alternatifs essais cliniques efficacité souris immunodéprimées injections sous-cutanées prednisolone suspension de cellules de C. albican tétracycline concentrations de curcuminoïdes lumière LED bleue contrôle négatif ANOVA de Welch tests de Games-Howell taches blanches pseudomembranes coupes histopathologiques
THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE
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Mima, E. G. d. O., Pavarina, A. C., Jordão, C. C., Vieira, S. M., Dovigo, L. N. Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis. J. Vis. Exp. (200), e65903, doi:10.3791/65903 (2023).

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