Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) in einem Mausmodell der oralen Candidiasis. aPDT wurde mit einer wasserlöslichen Mischung aus Curcuminoiden und blauem LED-Licht durchgeführt.
Abstract
Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) wurde in vitro umfassend untersucht, und präklinische Tiermodelle von Infektionen eignen sich zur Bewertung alternativer Behandlungen vor klinischen Studien. Diese Studie beschreibt die Wirksamkeit der aPDT in einem murinen Modell der oralen Candidiasis. Vierzig Mäuse wurden mit subkutanen Injektionen von Prednisolon immunsupprimiert, und ihre Zungen wurden mit einem Mundabstrich geimpft, der zuvor in einer C. albicans-Zellsuspension getränkt war. Tetracyclin wurde im Verlauf des Experiments über das Trinkwasser verabreicht. Fünf Tage nach der Pilzimpfung wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in acht Gruppen eingeteilt; Eine neunte Gruppe unbehandelter nicht infizierter Mäuse wurde als Negativkontrolle eingeschlossen (n = 5). Drei Konzentrationen (20 μM, 40 μM und 80 μM) eines Gemisches von Curcuminoiden wurden mit blauem LED-Licht (89,2 mW/cm 2; ~455 nm) und ohne Licht (C+L+- bzw. C+L-Gruppen) getestet. Licht allein (C-L+), keine Behandlung (C-L-) und Tiere ohne Infektion wurden als Kontrollen bewertet. Die Daten wurden mit Welchs ANOVA- und Games-Howell-Tests analysiert (α = 0,05). Eine orale Candidiasis wurde bei allen infizierten Tieren festgestellt und makroskopisch durch das Vorhandensein charakteristischer weißer Flecken oder Pseudomembranen auf dem Zungenrücken visualisiert. Histopathologische Schnitte bestätigten ein großes Vorhandensein von Hefen und Filamenten, die auf die keratinisierte Schicht des Epithels in der C-L-Gruppe beschränkt waren, und das Vorhandensein von Pilzzellen war in den Bildern von Mäusen, die einer aPDT mit entweder 40 μM oder 80 μM Curcuminoiden unterzogen wurden, visuell verringert. aPDT, vermittelt durch 80 μM Curcuminoide, förderte eine Reduktion der Koloniezahlen um 2,47 log10 im Vergleich zu denen in der C-L-Gruppe (p = 0,008). Alle anderen Gruppen zeigten keine statistisch signifikante Verringerung der Anzahl der Kolonien, einschließlich Photosensibilisatoren (C+L-) oder Licht allein (C-L+) Gruppen. Curcuminoid-vermittelte aPDT reduzierte die Pilzlast von den Zungen von Mäusen.
Introduction
Orale Candidiasis (OC) ist die Hauptpilzinfektion der Mundhöhle; es wird durch das Überwachsen von Candida spp. verursacht. Zu den prädisponierenden Faktoren für OC gehören endokrine Dysfunktion, der Einsatz von Breitbandantibiotika, Strahlen- und Chemotherapie, Ernährungsmängel, Xerostomie (niedriger Speichelfluss), Prothesengebrauch, schlechte Hygiene und insbesondere Immunsuppression1. Unter den Candida-Arten ist Candida albicans die am weitesten verbreitete und virulente; Es kommt als kommensale Spezies im menschlichen Körper und als opportunistischer Krankheitserreger vor. C. albicans hat die Fähigkeit, seine Morphologie von kommensalen Hefen (Blastoporen) zu pathogenen Filamenten (Hyphen und Pseudohyphen) zu ändern2. Die fadenförmigen Formen, insbesondere die Hyphen, können durch Endozytose oder aktives Eindringen in das Wirtsepithel eindringen und eine Infektionverursachen 3. Andere Virulenzfaktoren von C. albicans sind Adhäsion, Biofilmbildung und Sekretion von lipolytischen und hydrolytischen Enzymen und Toxinen wie Lipasen, Phospholipasen, Proteinasen und Candidalysin4.
OC-Behandlungen beinhalten die Verwendung von Antimykotika, insbesondere topischen Polyenen und Azolen (Nystatin und Miconazol)5. Sie zeigen jedoch nur eine kurzfristige Wirksamkeit, und es kommt häufig zu Rezidiven. Darüber hinaus hat der übermäßige Gebrauch von Antimykotika zu dem Problem der Entwicklung und Ausbreitung von Antimykotika geführt6. Daher sind alternative Therapien erforderlich, wie z. B. die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT), die einen Photosensibilisator (PS) und Licht mit einer geeigneten Wellenlänge (der gleichen wie die PS-Absorption) in Gegenwart von Sauerstoff kombiniert. PSs sind an Zellen gebunden oder werden von diesen aufgenommen und produzieren, wenn sie durch Licht aktiviert werden, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die für sensibilisierte Zellen toxisch sind7.
Bei der aPDT ist einer der verwendeten Photosensibilisatoren (PSs) Curcumin (CUR), eine natürlich vorkommende Verbindung, die aus den Rhizomen der Kurkumapflanze (Curcuma longa L.) gewonnen wird. Curcumin besitzt zahlreiche therapeutische Eigenschaften, darunter entzündungshemmende, antioxidative, krebshemmende und antimikrobielle Eigenschaften 8,9. Eine frühere Untersuchung ergab, dass aPDT unter Verwendung von CUR C. albicans in einem Mausmodell der oralen Candidiasis effektiv verringerte, ohne das Gewebe des Wirts zu schädigen10. CUR ist das wichtigste Curcuminoid, das aus Kurkuma gewonnen wird, aber auch andere Polyphenole wie Demethoxycurcumin und Bis-Demethoxycurcumin sind in dieser Pflanze enthalten. Curcuminoid-vermittelte aPDT zeigte antibakterielle Aktivität gegen Biofilme von Staphylococcus aureus, die in Kathetern gezüchtet wurden11. Nach unserem besten Wissen bleibt seine antimykotische Aktivität gegen C. albicans jedoch unklar. Daher haben wir in dieser Studie aPDT, die durch ein Curcuminoidsalz vermittelt wird, gegen C. albicans in einem Mausmodell von OC untersucht.
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Protocol
Das Forschungsprotokoll für die Verwendung von Mäusen wurde von der Ethikkommission für Tierverwendungen (Fallnummern 05/2008 und 09/2020) an der School of Dentistry, Araraquara, UNESP, genehmigt. C. albicans (ATCC 90028) wurde als Referenzstamm verwendet. Für die vorliegende Studie wurden sechs Wochen alte weibliche Schweizer Mäuse (n = 45) mit einem Bodymass-Bereich von 20-30 g verwendet. Die Tiere wurden von der São Paulo State University, UNESP, Botucatu, zur Verfügung gestellt.
1. Vorbereitung der PS und Auswahl der Lichtquelle für die aPDT
- Bereiten Sie das PS gemäß den Spezifikationen für den zu prüfenden Stoff vor.
HINWEIS: In dieser Studie wurde eine wasserlösliche Mischung von Curcuminoiden (wasserlösliche Salzmischung12 auf CUR-Basis) als PS verwendet (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Verdünnungen bei 20 μM, 40 μM und 80 μM (15,6, 29,2 bzw. 58,4 mg/l) wurden unmittelbar vor der Verwendung in Reinstwasser hergestellt und bei 5 °C aufbewahrt. - Wählen Sie ein Lichtgerät mit einer geeigneten Wellenlänge (die gleiche wie die der PS-Absorption), die in der Lage ist, das gesamte photosensibilisierte Ziel gleichmäßig und gleichzeitig zu beleuchten, ohne das Gewebe zu erhitzen.
HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Handstück mit einer Leuchtdiode (LED, siehe Materialtabelle) verwendet, das am Instituto de Física de São Carlos (Universität von São Paulo, São Carlos, SP, Brasilien) entwickelt wurde. Die Ausgangsleistung des Lichts betrug 89,2 mW/cm2 bei einer blauen Wellenlänge von ca. 455 nm.
2. Vorbereitung des C. albicans-Inokulums
- Bewahren Sie den Referenzstamm C. albicans (ATCC 90028) bis zur Verwendung in Hefe-Pepton-Glukose (YEPD, siehe Materialtabelle) mit 50% Glycerin bei -80 °C auf.
- Tauen Sie den gefrorenen Stamm bei Raumtemperatur auf, verteilen Sie ein 100-μl-Aliquot auf einer Petrischale mit Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) mit Chloramphenicol (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 48 h lang bei 37 °C.
- Fünf Kolonien in 10 ml Hefestickstoffbrühe mit 2% Glukose (YNBg) Medium überführen und 16 h lang aerob bei 37 °C wachsen.
- Die Hefekultur wird in frischem YNBg (1:10) verdünnt und aerob bei 37 °C inkubiert, bis die optische Dichte die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht.
HINWEIS: Standardisieren Sie zuvor die mikrobielle Wachstumskurve für jedes Labor. In der aktuellen Forschung durften die Kulturen etwa 8 Stunden lang inkubieren, bis sie die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichten, die durch die optische Dichte bei 540 nm (OD540) mit einem Mittelwert von 0,536 ± 0,062 beliebigen Einheiten (Mittelwert ± Standardabweichung [SD]) angezeigt wird. - Zentrifugieren Sie die Kultur 5 Minuten lang bei 5.000 x g bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit dem gleichen Volumen steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).
- Verwenden Sie 100-μl-Aliquote für vier serielle 10-fache Verdünnungen in PBS, verteilen Sie Verdünnungen auf SDA-Platten und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 °C für die Koloniezählung. Standardmäßig werden Pilzsuspensionen in Konzentrationen von ca. 4,5 × 107 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) verwendet.
3. Induktion von OC bei Mäusen
HINWEIS: Die folgende Methodik wurde zuvor von Takakura et al.13 beschrieben und von unserer Gruppe10,14 mit einigen Modifikationen reproduziert.
- Verteilen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in neun Gruppen (n = 5), was der gleichen Anzahl von Behandlungen entspricht (Ergänzungsdatei 1).
HINWEIS: Die Mundhöhle von Mäusen sollte negativ für das Candida-Wachstum sein. Dies muss durch Abstrich der Mundhöhle und Plattieren der Probe auf SDA überprüft werden. - Halten Sie die Tiere in Propylenboxen10 (max. 5 Mäuse pro Box) mit Holzspänen als Bodenbelag in einem temperaturkontrollierten Vivarium bei 23 ± 2 °C in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12/12 h. Es muss keine spezielle Anreicherung bereitgestellt werden.
- Halten Sie Mäuse mit extrudierter Mausdiät und gefiltertem Wasser ad libitum.
- Das Immunsuppressivum Prednisolon (100 mg/kg Körpergewicht, siehe Materialtabelle) wird am ersten Tag zum ersten Mal subkutan an alle Mitglieder der Gruppen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L-40, C+L-80, C-L+ und C-L- injiziert (Zusatzdatei 1).
HINWEIS: Halten Sie Mäuse aus derselben Gruppe in derselben Box und überwachen Sie sie täglich auf Anzeichen von Stress und Gewichtsverlust. Suchen Sie tierärztlichen Rat für schmerzstillende oder veränderte Lebensmittel/Wasser, wenn Stress oder Gewichtsverlust festgestellt werden. - Ab dem ersten Tag und bis zum Ende des Experiments Tetracyclinhydrochlorid in einer Menge von 0,83 mg/ml13 im Trinkwasser bereitstellen.
- Inokulieren Sie die Zungen von Mäusen am zweiten Tag, einschließlich der Gruppen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L-20, C+L-40, C+L-80, C-L+ und C-L- (Zusatzdatei 1), mit dem C. albicans-Inokulum . Impfen Sie diese Mäuse aus der negativen Kontrollgruppe (NCtrl) nicht.
- Tiere durch intramuskuläre Injektion von 10 mg/kg Chlorpromazinchlorid (siehe Materialtabelle) auf jeden Oberschenkelmuskel vor der Inokulation sedieren.
- Führen Sie eine intraorale Inokulation der Mäuse durch, indem Sie einen sterilen Tupfer (einen pro Tier) in eine frisch zubereitete (d. h. unmittelbar vor der Inokulation zubereitete) standardisierte Suspension von C. albicans einweichen.
- Legen Sie sedierte Mäuse in Rückenlage. Ziehen Sie ihre Zunge vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus dem Mund. Reiben Sie die Zunge jeder Maus 30 s lang mit einem eingeweichten Tupfer ein. Überwachen Sie Mäuse, bis sie sich von der Sedierung erholt haben.
- Verabreichen Sie am fünften Tag eine ergänzende subkutane Injektion von Prednisolon (100 mg/kg Körpergewicht), um die Immunsuppression aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist ausreichend, um die Infektion nach der intraoralen Impfung 7 Tage lang aufzubewahren. Die Zeitachse des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt.
4. Antimikrobielle photodynamische Therapie und Genesung von C. albicans von oralen Läsionen
- Am siebten Tag vor der Behandlung werden die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht) in Kombination mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) betäubt (siehe Materialtabelle).
- Jedes Tier wird in Rückenlage auf eine Polstervorrichtung14,15 gelegt, die mit Edelstahldrähten ausgestattet ist, die um die Schneidezähne geschlungen werden können, um das Maul offen zu halten.
HINWEIS: Isotherme Pads werden empfohlen, um die Mäuse während der Sedierung zu erwärmen, eine Unterkühlung bei Raumtemperatur zu verhindern und eine Mortalität im Zusammenhang mit der Anästhesiezu vermeiden 15. Jedes betäubte Tier sollte durch das Fehlen eines Entzugsreflexes überwacht werden, wenn die Zehen eingeklemmt werden, um die Anästhesietiefe zu bestätigen. Eine Erhaltungsdosis Ketamin zu 1/3 der ursprünglichen Dosis (ohne Xylazin) kann bei Bedarf verabreicht werden. - Legen Sie die Zunge bei eingezogenem Unterkiefer und Wangen vorsichtig aus dem Mund.
- Bei Mäusen aus C+L+-Gruppen pipettieren Sie 70 μl des PS auf den Zungenrücken (in einer der getesteten Konzentrationen). Halten Sie die Mäuse für eine Dauer von 20 Minuten als Vorbestrahlungszeit in einer dunklen Umgebung. Stellen Sie sicher, dass die Zunge jedes Tieres während dieser Zeit in der Mundhöhle positioniert bleibt, um zu verhindern, dass der Photosensibilisator (PS) verschluckt wird.
- Ziehen Sie nach der Photosensibilisierungsphase die Zunge zur Beleuchtung aus dem Mund. Setzen Sie das LED-Gerät auf den Zungenrücken und leuchten Sie mit 37,5 J/cm2 (7 min mit dem vorliegenden Gerät) (Abbildung 3).
- Bei Tieren aus den C+L-Gruppen pipettieren Sie 70 μl des PS in einer der getesteten Konzentrationen auf dem Zungenrücken und lassen Sie diese Mäuse 27 Minuten lang im Dunkeln.
- Bei Tieren aus der C-L+-Gruppe (mit Licht behandelt, ohne vorherige Photosensibilisierung) 70 μl sterile Kochsalzlösung auf den Zungenrücken pipettieren. Lassen Sie die Mäuse 20 Minuten lang im Dunkeln und beleuchten Sie dann ihre Zunge mit 37,5 J/cm2 (7 Minuten mit dem vorliegenden Gerät).
- Bei Mäusen aus der C-L-Gruppe (weder mit PS noch mit Licht behandelt) 70 μl sterile Kochsalzlösung auf den Zungenrücken pipettieren und 27 min im Dunkeln halten.
- C. albicans sofort nach der Behandlung aus der Zunge aller Mäuse gewinnen. Tupfen Sie den Zungenrücken 1 Minute lang mit einem sterilen Wattestäbchen ab.
- Legen Sie jeden Probentupfer in ein Röhrchen mit 1 ml steriler Kochsalzlösung und wirbeln Sie ihn 1 Minute lang auf, um die mikrobiellen Zellen zu resuspendieren.
- Führen Sie sofort 10-fache serielle Verdünnungen in PBS durch und plattieren Sie 25-μl-Aliquots in doppelter Ausführung über SDA-Platten. Die Platten werden 48 h lang aerob bei 37 °C inkubiert.
- Verwenden Sie nach 48 Stunden einen digitalen Koloniezähler (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der Hefekolonien zu bestimmen. Berechnen Sie die C. albicans-Belastung (KBE/ml) für jedes Tier.
- Transformieren Sie KBE/ml-Werte in log10 und analysieren Sie sie ordnungsgemäß gemäß dem Design des Experiments und den Datenannahmen.
HINWEIS: In der vorliegenden Untersuchung wurde Welchs Einweg-ANOVA und der Games-Howell-Post-hoc-Test (α = 0,05)16 verwendet.
5. Histopathologische Analysen
- Am achten Tag werden Mäuse mit Ketamin in einer Dosis von 100 mg/kg in Kombination mit Xylazin in einer Dosis von 10 mg/kg durch intraperitonielle Injektion betäubt und mit einer Überdosis Ketamin (200 mg/kg intraperiotonisch verabreicht) eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod, indem Sie auf das Fehlen von Atembewegungen (Apnoe) und das Fehlen von Herzschlag (Asystolie) prüfen.
- Kneifen Sie die Zunge vorsichtig zusammen und ziehen Sie sie aus dem Maul des Tieres. Machen Sie mit einem manuellen Skalpell einen Schnitt vor den zirkumvallaten Papillen, um die gesamte Zunge chirurgisch zu entfernen, ohne Verletzungen im vorderen und mittleren Bereich zu verursachen.
- Fixieren Sie die Zunge 24 h lang in 10% gepuffertem Formalin (pH 7,2-7,4) und waschen Sie sie 2 h lang unter fließendem Wasser.
- Fahren Sie mit der Aufnahme in den Paraffinprozess fort: Dehydratisierung, Klärung und Imprägnierung10,14.
- Schneiden Sie serielle Schnitte (5 μm dick) mit einem Mikrotom und befestigen Sie die Schnitte dann auf Objektträgern. Fahren Sie fort, diese Schnitte mit periodischer Säure-Schiff und Hämatoxylin (PAS-H) für die histopathologische Untersuchung und die Identifizierung von Pilzen durch Beobachtung unter einem Lichtmikroskop zu färben.
- Bitten Sie einen Pathologen, vorzugsweise blind für die untersuchten Gruppen, die Gewebereaktion aufgrund einer C . albicans-Infektion zu untersuchen.
- Beschreiben Sie die histologischen Eigenschaften des Gewebes (Epithel und Bindegewebe), insbesondere lokale Entzündungsreaktionen unterschiedlicher Intensität.
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Representative Results
Das Mausmodell der OC zeigte typische weiße Flecken und Pseudomembranen auf der Zunge aller infizierten Mäuse (Abbildung 4A). C. albicans , die von C-L-Tieren gewonnen wurden, bestätigten eine Gewebebesiedlung durch diesen Mikroorganismus (Werte lagen zwischen 1,62 x 104 und 4,80 x 105 KBE/ml). Wie erwartet zeigten die Tiere aus der NCtr-Gruppe nach der Probenahme keine Gewebeveränderungen oder Koloniewachstum (Abbildung 4B).
aPDT verringerte die Lebensfähigkeit von C. albicans , wenn Curcuminoide bei 80 μM zur Photosensibilisierung verwendet wurden (Abbildung 5). Die mittlereLog-10-Reduktion , die mit 80 μM PS-vermittelter aPDT erreicht wurde, betrug 2,47, verglichen mit der in der C-L-Gruppe (p = 0,008).
Die Anzahl der C. albicans-Kolonien , die aus Mäusezungen gewonnen wurden, unterschied sich nicht signifikant zwischen Mäusen, die mit Curcuminoiden ohne Beleuchtung behandelt wurden (C+L-Gruppen), Mäusen, die mit Licht, aber nicht zuvor photosensibilisiert wurden (C-L+-Gruppen), und unbehandelten Mäusen (C-L-Gruppe) (p ≥ 0,210).
Die histologischen Merkmale der Zungen nicht infizierter Tiere (NCtr) zeigten normales/gesundes Gewebe, einschließlich intakter Lamina propria, Basalmembran und fadenförmiger Papillen (Abbildung 6A). Im Gegensatz dazu war bei der Untersuchung der histopathologischen Bilder der Mäusezungen aus der C-L-Gruppe offensichtlich, dass Hefen und Filamente in der keratinisierten Schicht des Epithels vorhanden waren, obwohl keine Pilze infiltriert wurden. Im darunter liegenden Bindegewebe wurde eine leichte Entzündungsreaktion beobachtet, die hauptsächlich durch mononukleäre Zellen vermittelt wurde, und fadenförmige Papillen fehlten (Abbildung 6B). Die histologische Analyse der Zungen von Mäusen sowohl in der C+L- als auch in der C-L+-Gruppe zeigte ähnliche Merkmale. Im Gegensatz dazu zeigten die Zungenschnitte von Mäusen, die mit 80 μM Curcuminoid-vermittelter aPDT behandelt wurden, eine reduzierte Anzahl von Pilzzellen, die hauptsächlich auf die keratinisierte Schicht des Epithels beschränkt waren (Abbildung 6C).
Abbildung 1: Chemische Struktur des Photosensibilisators. Die chemische Struktur des als Photosensibilisator verwendeten wasserlöslichen Salzgemisches, das zu 53,4 % aus natürlichem Curcumin und zu 46,6 % aus anderen Curcuminoiden (Demethoxycurcumin und Bis-Demethoxycurcumin) besteht. Das endgültige durchschnittliche Molekulargewicht beträgt 730,32 g/mol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Protokollzeitleiste für das Mausmodell der oralen Candidiasis und aPDT. Eine Zeitleiste, die das Protokoll für das Mausmodell der oralen Candidiasis und der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) skizziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beleuchtung von Mäusezungen nach Photosensibilisierung. Nach der Photosensibilisierung (Inkubation des infizierten Gewebes mit dem Photosensibilisator) wurden die Zungen mit einem blauen (~455 nm) LED-Licht bei 37,5 J/cm2 beleuchtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Weiße Läsionen im murinen oralen Candidiasis-Modell. (A) Repräsentative Bilder, die die weißen Läsionen darstellen, die im Mausmodell der oralen Candidiasis beobachtet wurden. (B) Negative (nicht infizierte) Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Candida albicans , die sich von den Zungen von Mäusen erholt haben. Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von log10 (KBE/ml) aus den Behandlungsgruppen dar. Welchs Einweg-ANOVA zeigte, dass die Auswirkungen der Behandlungen zwischen den Gruppen statistisch signifikant unterschiedlich waren (p < 0,001). Verschiedene Kleinbuchstaben (a, b, c) neben den Mittelwerten weisen auf statistisch signifikante Unterschiede nach dem Games-Howell-Test hin (S≤ 0,030). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Bilder histologischer Schnitte von Mäusezungen. Histologische Schnitte von Mäusezungen wurden mit PAS-H gefärbt und die Bilder wurden bei 200x aufgenommen. (A) Negativkontrollmäuse ohne induzierte orale Candidiasis, Photosensibilisierung und Beleuchtung (NCtr-Gruppe). (B) Mäuse mit induzierter oraler Candidiasis, weder photosensibilisiert noch LED-Beleuchtung ausgesetzt (C-L-Gruppe). (C) Tiere mit induzierter oraler Candidiasis, die 80 μM Curcuminoide und 37,5 J/cm2 LED-Beleuchtung (C+L+ 80-Gruppe) ausgesetzt waren. Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Experimentelle Gruppen. Eine Auflistung der in der vorliegenden Studie verwendeten Versuchsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
C. albicans wurde mit oralen und ösophagealen Infektionen bei Personen mit immungeschwächtem Zustand, Diabetes mellitus, längerem Gebrauch von Antibiotika und schlechter Mundhygiene in Verbindung gebracht 1,3. Die Untersuchung menschlicher Infektionskrankheiten erfordert sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Untersuchungen, bevor klinische Studien sicher und genau konzipiert werden können. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode zur Etablierung eines murinen OC-Modells, mit dem die Pathogenese oraler Infektionen durch C. albicans und die Wirksamkeit von antimykotischen Ansätzen bewertet werden können 15,16,17,18,19.
Das hier verwendete murine Modell der OC wurde erfolgreich etabliert, was durch die erhebliche Wiederherstellung der Pilzlast aus Läsionen sowie durch die charakteristischen Infektionsmerkmale belegt wird, die in den makroskopischen und histopathologischen Analysen der Zungen infizierter Mäuse beobachtet wurden. Viele Studien haben ähnliche Mausmodelle von OC verwendet. In solchen Modellen werden weibliche Mäuse immunsupprimiert und mit C. albicans geimpft, was zu Läsionen auf der Zungeführt 10,13,14,15,20,21. Die Immunsuppression mit Prednisolon, einem Glukokortikoid, hemmt die Aktivität von Neutrophilen gegen C. albicans22. In dieser Studie wurden weibliche Mäuse mit zwei subkutanen Injektionen von Prednisolon immunsupprimiert, einen Tag vor und drei Tage nach der Infektion mit C. albicans13. Darüber hinaus verursachte die Verabreichung von Tetracyclin im Trinkwasser während des Experiments eine orale Dysbiose, indem sie orale Bakterien störte und C. albicans zum Gedeihen verhalf23,24. Darüber hinaus hinderte die durch die intramuskuläre Injektion von Chlorpromazinchlorid verursachte Sedierung die Tiere daran, unmittelbar nach der Impfung Wasser zu trinken und zu fressen. So blieben Pilzzellen länger mit dem Zungenrücken in Kontakt, was die Entwicklung von Keimschläuchen und den Übergang von Hefen zu Filamenten (Hyphen und Pseudohyphen) ermöglichte, die die pathogenen Morphologien von C. albicans sind, die in das menschliche Epithel eindringen können. Teichert et al.25 verwendeten ein Immundefizienzprotokoll, um OC bei Mäusen zu induzieren, und gewannen nur 2 x 102 KBE/ml von C. albicans.
Während Totti et al.26 sialoadenektomierte Mäuse verwendeten und vier separate Inokulationen mit einer C. albicans-Suspension durchführten, ist es bemerkenswert, dass in ihrem Fall die Infektion bei den meisten Tieren im Verlauf des Experiments nicht aufrechterhalten wurde. Im Gegensatz dazu wurde in der vorliegenden Studie die Inokulation mit Pilzzellen nur einmal durchgeführt und führte zur Rückgewinnung von 104 KBE/ml von C. albicans aus der Mundhöhle. In dieser Studie wurde das von Takakura et al.13 beschriebene Mausmodell der Candidiasis verwendet, die eine orale Inokulation mit einem klinischen Stamm durchführten, der von einem Patienten mit kutaner Candidiasis (106 KBE/ml) isoliert wurde. Drei bis sieben Tage nach der Inokulation wurden 105-10 6 KBE/ml von C. albicans aus der Mundhöhle von Mäusen gewonnen13. Die Unterschiede zwischen der Methode von Takakura et al.13 und dieser Studie umfassen die Verwendung unterschiedlicher Pilzkonzentrationen im Inokulum (in dieser Studie wurden 107 KBE/ml von C. albicans verwendet) und verschiedener C. albicans-Stämme für die orale Inokulation (hier wurde der Referenzstamm ATCC 90028 verwendet). Carmello et al.20 verwendeten ein ähnliches Protokoll, bei dem immunsupprimierte Tiere verwendet wurden. Sie verabreichten den Tieren jedoch an den Tagen 1, 5, 9 und 13 des Experiments zwei zusätzliche subkutane Injektionen von Prednisolon. Ihre Studie ergab eine positive Korrelation zwischen den Werten, die den oralen Läsionen der infizierten Tiere zugewiesen wurden, und der Anzahl der KBE/ml über einen Zeitraum von 5 bis 16 Tagen nach der Infektion. In früheren Forschungen wurde allgemein festgestellt, dass es wichtig ist, Tiere unter Narkose genau zu überwachen, um Unterkühlung zu verhindern. Zusätzliche Erhaltungsdosen von Ketamin sollten nur bei Bedarf mit Diskretion verabreicht werden27.
In Bezug auf die Wirksamkeit der aPDT-Anwendung zeigten die Ergebnisse, dass die Bestrahlung von Zungen, die zuvor mit einem 80 μM Curcuminoidsalzgemisch behandelt wurden, eine signifikante Verringerung (2,47 log10) der Lebensfähigkeit von C. albicans verursachte. Histologische Analysen ergaben, dass Schnitte von Zungen, die mit 80 μM Curcuminoid-vermittelter aPDT behandelt wurden, eine reduzierte Anzahl von Pilzzellen, die auf die keratinisierte Schicht beschränkt waren, und eine geringe Entzündungsreaktion zeigten. Es ist erwähnenswert, dass bei allen Mäusen, die mit C. albicans infiziert waren, eine Entzündungsreaktion festgestellt wurde. Diese Beobachtung impliziert, dass die in allen aPDT-Gruppen beobachtete Entzündung mit einer Candida-Infektion zusammenhängen könnte und nicht auf aPDT zurückgeführt wird, ein konsistenter Befund im Einklang mit unseren früheren Untersuchungen 10,13,14,15.
Frühere Untersuchungen verwendeten CUR, Methylenblau und Photodithazin (PDZ) als PSs und lieferten vielversprechende Ergebnisse 10,20,24,25,27. In einer ähnlichen Studie10 führte eine kombinierte Exposition gegenüber CUR- und LED-Licht zu einer signifikanten Verringerung der Lebensfähigkeit von C. albicans; die Verwendung von 80 μM CUR und Licht reduzierte jedoch die Lebensfähigkeit von Pilzen um 4,0 log10. Dovigo et al.10 verwendeten nur CUR als PS, während wir ein Salz verwendeten, das die drei Haupt-Curcuminoide von C. longa enthielt. Als CUR (260 μM) und LED-Licht an fünf aufeinanderfolgenden Tagen zur Behandlung der oralen Candidiasis bei Mäusen verwendet wurden, beobachteten die Autoren eine Verringerung der Pilzlebensfähigkeit um 1,11 log10 21. Wenn Methylenblau als PS in 450 μg/ml und 500 μg/ml verwendet wurde, beseitigte aPDT C. albicans vollständig aus der Mundhöhle von Mäusen25. Darüber hinaus wurde bei aPDT durch PDZ (100 mg/l) eine 3,0 log10-Reduktion und eine vollständige Remission der oralen Läsionen beobachtet20. Darüber hinaus erhöhte aPDT die TNF-α-Expression im Vergleich zu der in der unbehandelten Gruppe20. In einer Studie, in der ein Fluconazol-resistenter Stamm verwendet wurde, förderte aPDT, vermittelt durch PDZ (200 mg/l), eine Reduktion, die 1,3 log1027 entsprach. Darüber hinaus führte die Kombination von aPDT mit Nystatin zu einer erheblichen Verringerung der Lebensfähigkeit von Pilzen, was einer Abnahme von 2,6 log10 entspricht, zusammen mit bemerkenswerten Verbesserungen der oralen Läsionen und einer Verringerung der Entzündungsreaktion27. Zusammengenommen liefern diese Studien überzeugende Beweise für die Wirksamkeit von aPDT bei der Verringerung der Pilzlast innerhalb des Mausmodells der oralen Candidiasis und unterstreichen ihr Potenzial als klinische Behandlungsoption aufgrund ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit, ohne das Wirtsgewebe zu schädigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Studie verwendete Mausmodell der OC geeignet ist, um eine Infektion nachzuahmen und die Wirksamkeit der aPDT zu bewerten. Als Einschränkung verwendete das hier verwendete OC-Modell nur einen Referenzstamm von C. albicans (andere Stämme, klinische Isolate und Nicht-Albicans-Candida-Arten wurden nicht bewertet). Darüber hinaus ahmt die Kortikosteroid-induzierte Immunsuppression, die bei Mäusen zur Entwicklung einer oralen Infektion verwendet wird, möglicherweise keine anderen Immunschwächezustände nach, wie z. B. die aufgrund einer HIV-Infektion. Es kann auch Unterschiede in den Wirtsbedingungen für die Entwicklung von OC geben, wie z. B. die orale Mikrobiota von Mäusen und Menschen. Dieses Protokoll sollte weiter ausgebaut werden, um gemischte Biofilme zu bewerten, die von mehr als einer Art oder von verschiedenen Stämmen derselben Art gebildet werden. Darüber hinaus sind die ausreichende Sedierung von Mäusen und die Verhinderung von Unterkühlung bei gleichzeitiger Vermeidung anästhesiebedingter Mortalität die schwierigsten Schritte des Protokolls.
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Acknowledgments
Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch FAPESP (São Paulo Research Foundation, Prozessnummer FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) und 2008/00601-6. Wir danken auch Dr. Ana Paula Silva für die Bereitstellung der Informationen über das wasserlösliche Salz auf CUR-Basis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
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